红细胞微粒与冠心病关系的研究进展

廖海霞 综述 张薇 马骁 审校

(1.山东大学心血管重构与功能研究教育部和卫生部重点实验室山东省心血管疾病转换医学重点实验山东大学齐鲁医院心血管内科，山东 济南 250012；2.济南解放军第456医院心血管内科，山东 济南 250031)



红细胞微粒与冠心病关系的研究进展

廖海霞1综述 张薇1马骁2审校

(1.山东大学心血管重构与功能研究教育部和卫生部重点实验室山东省心血管疾病转换医学重点实验山东大学齐鲁医院心血管内科，山东 济南 250012；2.济南解放军第456医院心血管内科，山东 济南 250031)

各种细胞(比如血小板、内皮细胞、白细胞、红细胞及血管平滑肌细胞等)在激活或者程序性细胞死亡的过程中，产生并释放于外周血中的直径为0.1～1 μm的小囊泡被称为细胞微粒，细胞微粒在结构上保留了一部分前体细胞所特有的细胞膜、细胞质，甚至一些简单的细胞器，由红细胞释放的小囊泡称之为红细胞微粒(erythrocyte-derived microparticles，ErMPs)[1]。ErMPs在调节血管内皮细胞功能[2]以及血栓形成[3-4]、炎症反应[5-6]等方面都有重要的作用，近年来一些研究发现冠心病患者冠状动脉及外周血中ErMPs明显升高[7-8]，因而ErMPs有望成为冠心病血栓形成时的新标志物。现主要将ErMPs的形成机制及其在冠心病中的作用做一概述。

1 ErMPs概述

1.1 ErMPs的形成

ErMPs是在炎症反应、缺氧等各种刺激因素作用下红细胞激活或者程序性细胞死亡时的产物，ErMPs的形成和释放贯穿于红细胞的整个老化过程。目前发现能够诱导红细胞产生ErMPs的物质有血流切应力、补体蛋白C5b-9、氧化产物或者程序性细胞死亡前的刺激[9]。ErMPs的形成与带3蛋白(Band 3蛋白)密切相关。Band 3蛋白是一种多次跨膜糖蛋白，它是红细胞膜中主要的膜蛋白，Band 3蛋白胞浆区有膜骨架蛋白、血红蛋白等的结合位点以及磷酸化位点，是连接Band 4.1、Band 4.2、CD47以及锚定蛋白等膜骨架蛋白的枢纽[10]。Band 3蛋白通过与这些膜骨架蛋白的连接维持红细胞膜的结构稳定。炎症反应、缺氧等刺激通过影响Band 3蛋白以及内膜微环境，使细胞骨架张力和膜弯曲力之间的平衡被破坏，从而促进膜骨架的重排和出芽，最终产生ErMPs。目前比较受认可的Band 3蛋白介导的ErMPs形成模式有两种：Band 3蛋白聚簇模式和红细胞程序性细胞死亡模式。在Band 3蛋白聚簇模式中，氧化应激促使高铁血色原的形成，高铁血色原与Band 3蛋白结合能够刺激Band 3蛋白聚簇的产生，聚簇化的Band 3蛋白与循环中的IgGs具有较强的亲和性，因此大量IgGs沉积于红细胞表面，诱发红细胞膜自身囊泡化[11]，最后形成ErMPs。红细胞程序性细胞死亡模式中，钙离子的内流激活钙蛋白酶、谷氨酰胺转移酶2等，使磷酸酪氨酸激酶和磷酸酪氨酸磷酸酶对细胞膜Band 3蛋白酪氨酸的调节失衡，导致Band 3蛋白磷酸化显著增加。Band 3蛋白胞浆区的磷酸化能降低其与锚定蛋白的结合，以锚定蛋白为中介的细胞骨架网络的形成因而受到影响，最后降低膜结构的稳定性[12-13]。ErMPs的形成机制尚未完全阐明，仍需进一步的研究和探讨。

1.2 ErMPs的组成

通过离心分离、蛋白组学等方法研究发现ErMPs的成分有红细胞骨架相关的分子、膜蛋白、代谢相关蛋白、血红蛋白、信号分子(如磷脂酶、同源IgG)、补体等。ErMPs的组成与红细胞不完全相同，并且ErMPs的主要成分随着红细胞所受到的刺激的不同而有所变化[14-15]，目前被证实的主要有富含Band 3蛋白、血型糖蛋白、补体调节蛋白、糖肌醇磷脂-锚定蛋白(GPI锚定蛋白)或脂筏标记蛋白的ErMPs。在富含脂筏标记蛋白的ErMPs的形成过程中，细胞骨架蛋白的氧化应激会促进膜表面的样蛋白寡聚物侧向移动，使脂筏重排，诱导胞膜上的脂块出芽，样蛋白和GPI锚定蛋白从细胞分离，最终形成富含脂筏标记蛋白的ErMPs[15-16]。ErMPs膜表面保留一些红细胞的表面蛋白抗原，如CD235a(+)(血型糖蛋白A)、CD105(-)、CD45(-)、CD47、CD35(一种膜转运蛋白)、CD55(一种GPI锚定蛋白)、CD59[17-18]。CD47是正常红细胞膜表面的一种蛋白，巨噬细胞能够识别CD47从而不会吞噬红细胞，而ErMPs的释放使红细胞膜表面的CD47表达减少时，巨噬细胞因不能更好地识别，因此会将红细胞视为异己物质而将其吞噬清除[19]。

2 ErMPs的检测

随着人们对ErMPs的临床应用研究的兴趣逐渐增大，ErMPs的检测技术也得到人们的研究和重视。目前ErMPs的检测方法有以下几种。

2.1 显微镜观察

细胞微粒的直径<1 μm，使用共聚焦显微镜和透射电子显微镜等特殊显微镜才可以观察到细胞微粒。随着高分辨率激光扫描共聚焦显微镜技术的发展，不仅可以通过它直接观察细胞微粒的大小、形态及内部结构，还可以动态观察细胞微粒的蛋白水解作用[20]。另外，在免疫组织化学技术的基础上发展而来的免疫电镜技术也可以帮助人们定位观察细胞微粒膜表面上的抗原等[21]。

2.2 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法是免疫酶测定法的一种，该法利用纯化的抗体与细胞微粒结合进行检测，具有灵敏度高、不受细胞微粒大小的限制、一次能完成大量标本检测等优点。缺点是检测结果容易受抗原、抗体质变等因素的干扰；而且该法无法分辨检测物质的大小，因而检测结果中可能包含细胞碎片、程序性细胞死亡小体等杂质[22]。上述缺点限制了其在细胞微粒检测领域的应用。

2.3 流式细胞术

这种方法具有简便快捷以及可以进行多元荧光标记检测的优势，是目前临床广泛应用的一种检测方法[23]。流式细胞术不仅可以检测ErMPs的来源，还可以对其进行半定量分析。传统的流式细胞术对于直径<0.30 μm的细胞微粒不敏感，随着技术的进步，目前能够检测到直径最小约0.10 μm的细胞微粒[23]，但是由于各方面因素的影响，目前仍没有一个统一的标准化检测过程。结合免疫荧光技术，可以更精确地检测到细胞微粒的数目和来源，以及如何利用免疫荧光技术检测到直径更小的细胞微粒是目前研究的热点[24]，Grisendi等[25]提出了联合羟基荧光素二醋酸琥珀酰亚胺脂、CD235a(+)和膜联蛋白V多参数着染的方法来测定ErMPs。Xiong等[26]提出了在预先设定的ErMPs计数比值下，混合使用校准珠子和计数珠子来消除荧光干扰信号的方法；但这些改进的流式细胞术仍需慎重探究。

2.4 蛋白组学

最近，蛋白组学也被应用到ErMPs的研究中[27]。该技术能用来对ErMPs进行定性分析，尤其在输血领域得到广泛应用[28]。由于ErMPs的形成复杂，完整的蛋白质谱尚未明了。随着质谱分析和激光解析技术的应用，拓宽了细胞微粒上蛋白质的检出范围，蛋白质组学技术将来可能成为检测ErMPs的可靠方法[18]。

3 ErMPs与冠心病

ErMPs在调节血管内皮细胞功能以及血栓形成、炎症反应等方面都有重要的作用，而这些环节与冠心病的发生、发展密切相关，因此ErMPs成为了目前人们研究的热点。

3.1 ErMPs与内皮细胞

冠心病的发生与血管内皮细胞损伤及其功能异常有密切关系[29]。正常血管的舒张功能主要受L-精氨酸、一氧化氮合酶、一氧化氮(NO)系统调控。NO有拮抗动脉粥样硬化的作用，该作用的前提是有充足的NO。充足的NO能够调整血小板的功能、白细胞的黏附和渗出，抑制低密度脂蛋白的氧化，防止血管平滑肌细胞增殖。在红细胞老化过程中，会产生含有血红蛋白的ErMPs和游离血红蛋白，它们所含的亚铁离子能迅速与NO反应，促进NO从体内清除，从而降低NO的生物利用度[2]。ErMPs、游离血红蛋白与NO的反应速度差不多，两者约为红细胞与NO的反应速度的1 000倍[30-31]。在动物实验中，往老鼠体内注射很少量的ErMPs、游离血红蛋白就能促进血管明显的收缩反应，进一步提示ErMPs对于人体内NO的清除起着重要的作用[32]。在冠心病的早期阶段，内皮细胞会随着NO的减少变得脆弱，增加受到损伤的可能性，白细胞的渗出也随之增多，并且内皮下层低密度脂蛋白也更容易氧化。同时，血管平滑肌细胞的增殖会使新生内膜变厚。在冠心病的晚期阶段，NO的减少使血小板更容易被激活，从而增加血栓形成和心肌梗死的风险。综上，NO生物利用度的下降能促进动脉粥样硬化各个时期的进展。另外，Camus 等[32]在研究镰刀型贫血老鼠血液中的ErMPs与其肾血管血栓形成的关系中，发现ErMPs会损伤内皮细胞，从而影响血管的舒张功能。

3.2 ErMPs与血栓形成

冠心病患者血栓形成主要继发于斑块纤维帽的破裂，斑块破裂时会使大量ErMPs释放出来，循环中的ErMPs也会增多，ErMPs在血栓形成中有重要的作用。Liu等[7]的研究结果表明急性冠状动脉综合征患者血液中ErMPs较健康对照组明显升高，而且ST段抬高型心肌梗死患者升高的幅度高于非ST段抬高型急性冠状动脉综合征患者。Suades等[8]通过检测外周血ErMPs及其表达的CD235a(+)的水平，发现ST段抬高型心肌梗死患者比健康对照组明显升高，再灌注治疗前较再灌注治疗后明显升高。正常细胞膜的磷脂呈不对称分布，磷脂酰胆碱和鞘磷脂位于外层，磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸位于内层，这种不对称需要消耗能量来维持。由于ErMPs膜上的磷脂分布的不对称性消失，使得大量带负电荷磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸分布于膜的外层。带负电荷的磷脂酰丝氨酸与凝血蛋白上带正电荷的γ-羧基谷氨酸产生静电作用，故较为容易与凝血因子结合。此外，磷脂酰丝氨酸是最有效的组织因子启动剂，它给凝血酶原酶和酶复合物提供结合位点，从而激活因子Ⅷ、Ⅸ和Ⅺ及凝血级联反应，导致血栓的形成[3]。Liu等[7]的临床研究也证实了急性冠状动脉综合征患者血液中的ErMPs缩短了凝血时间，并促进因子X的激活以及凝血酶原酶的形成。

在慢性溶血性贫血疾病中，ErMPs的升高与高凝状态、纤溶系统以及内皮细胞功能的激活明显相关[4]。Zecher等[33]发现镰刀型贫血老鼠血液中的ErMPs明显高于野生型的，他们分别从镰刀型贫血老鼠和野生型老鼠体内提取ErMPs，经过浓缩后注射到镰刀型贫血老鼠体内，发现来自镰刀型贫血老鼠的ErMPs能够明显促进受试老鼠血液中磷脂酰丝氨酸阳性的细胞微粒的形成，而来自野生型的ErMPs作用很弱；另外，他们还发现镰刀型贫血老鼠血液中ErMPs能够明显减慢老鼠肾血管的舒张期血流速度和平均血流速度，上述发现均提示镰刀型贫血老鼠血液中的ErMPs与肾血管血栓形成明显相关。

3.3 ErMPs与炎症反应

有研究表明ErMPs通过促进选择素P与其配体的相互作用，以及通过提高C反应蛋白、免疫球蛋白和CD11b的数量，间接诱导中性粒细胞的趋化作用[5-6]，从而促进炎症反应。Zecher等[33]分别往健康小鼠和脂多糖诱导的脓毒血症模型小鼠体内注射纯化的ErMPs，通过分析两组小鼠血浆中白介素-6、角化细胞源性趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1等炎性因子的水平，得出的结论是ErMPs能够在炎症的环境中放大肺泡巨噬细胞、脾脏巨噬细胞释放炎性因子的作用。另外，该实验还验证了ErMPs在补体5a受体缺失的小鼠体内无法诱导炎性因子的释放，进一步说明了ErMPs可通过补体活化经典途径，促进炎性因子的释放。

另外，ErMPs可能有抗炎作用。Sadallah等[17]发现ErMPs能够持续抑制炎性因子肿瘤坏死因子-α、白介素-10的释放。ErMPs还可以通过调节膜上磷脂酰丝氨酸的表达或者其他机制间接抑制巨噬细胞的活性，从而影响炎症的产生过程。总之，目前有关ErMPs对炎症反应起了促进还是抑制作用的问题尚未有统一定论，仍需继续探讨。

4 结束语

ErMPs由红细胞活化或者程序性细胞死亡时产生，具有重要的生物学作用。ErMPs在冠心病中的作用也在不断地被发现，如损伤内皮细胞功能，促凝、促炎活性，但其作为一种新兴的生物标志物，各方面的具体作用机制仍然需要进一步的探讨。相信随着针对ErMPs的研究越来越深入，将为冠心病的诊治、诊疗途径提供一些新的靶点。

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Current Advancements of Erythrocyte-derived Microparticles in Coronary Heart Disease

LIAO Haixia1,ZHANG Wei1,MA Xiao2

(1.TheKeyLaboratoryofCardiovascularRemodelingandFunctionResearch,ChineseMinistryofEducationandChineseMinistryofHealth;TheStateandShandongProvinceJointKeyLaboratoryofTranslationalCardiovascularMedicine,DepartmentofCardiology,QiluHospitalofShandongUniversity,Jinan250012,Shandong,China；2.DepartmentofCardiology,The456thHospitalofPLA,Jinan250031,Shandong,China)

国家自然科学基金(81470560)

廖海霞(1990—)，在读硕士，主要从事冠心病相关研究。Email:liaohaixia20@163.com

张薇(1954—)，主任医师，博士生导师，主要从事冠心病相关研究。Email:zhangweisdu7@163.com

马骁(1967—)，副主任医师，主要从事冠心病相关研究。Email:xmajn@163.com

2016-04-02