表达hCD4和hCCR5基因的慢病毒载体的构建

李雅婧　诸葛福艳　梁娟　何金洋　谭宁　曾常春

摘要：目的：构建一种高效转染hCD4和hCCR5基因的慢病毒载体。方法：应用Gateway技术构建可表达hCD4和hCCR5的质粒载体PLA.ExBi.P/puro-CMV-CD4-IRES-CCR5，并进行酶切和测序鉴定，进行慢病毒包装，用qRT-PCR方法检测293T細胞中hCD4/CCR5的mRNA表达。将本慢病毒载体转染于小鼠白血病细胞L615，应用qRT-PCR检测细胞内hCD4/CCR5 mRNA的表达及对HIV-1的易感性。结果：成功构建PLA.ExBi.P/puro-CMV-CD4-IRES-CCR5质粒表达载体，包装成的慢病毒载体在293T细胞中具有hCD4/CCR5 mRNA水平的高表达（P<0.05）；转染于L615细胞亦表现出hCD4/CCR5 mRNA水平的高表达（P<0.05），并具备了HIV-1入胞感染的特点。结论：成功建立hCD4和hCCR5基因双启动的慢病毒载体，可使目的细胞高效表达hCD4及hCCR5分子，对HIV-1宿主细胞的制备、HIV/AIDS的发病机制和抗病毒研究具有积极的意义。

关键词：慢病毒载体；hCD4/hCCR5；质粒；基因表达

中图分类号：R318 文献标志码：A 文章编号：1008-2409（2016）05-0006-06

慢病毒是一类逆转录病毒，包括人免疫缺陷病毒（HIV）、猿免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV）和猫免疫缺陷病毒（feline immunode ficiency virus，FIV）等。慢病毒可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到长期稳定表达。作为一种体外基因运输的工具，与其他逆转录病毒相比，慢病毒不但能感染分裂细胞，而且还能感染非分裂细胞，已发展为转基因动物和基因治疗研究的重要工具。hCD4分子是一种膜分子，主要表达于辅助T（Th）细胞，也是HIV-1入侵细胞的主要受体。hCCR5作为G蛋白偶联因子超家族（GPCR）成员的细胞膜蛋白，是细胞内β趋化因子（RANTES、MIP-lα和MIP-1β）的受体，亦是HIV-1入侵机体细胞的主要辅助受体之一。本实验通过构建hCD4/CCR5基因慢病毒载体，为新的HIV-1宿主细胞研制提供基本条件。

1材料与方法

1.1材料

GatewaySPCIonase^TMⅡEnzymeMix、GatewayLRClonaseTMⅡPlus Enzyme Mix购自invitrogen公司，QIAquick Gel Extraction Kit购自QIAGEN公司，质粒小提试剂盒购自TIANGEN公司，PrimeSTAR^TMHSDNA Polymeras、Taq DNA Polymerase、dNTP Mix、GeneRuler^TM100 bp DNA Ladder购自Takara公司，细胞培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、双抗（青霉素/链霉素）、胰酶购自GIBCO公司，包装质粒混合物（ViraPower^TMPackaging Mix）由pHelper1.0、pHelper2.0、LV3/LV5 3个质粒成比例混合而成，购自美国Invitrogen公司慢病毒转染试剂盒，转染混合液：Opti-MEM I、Lipofeetamine 2000购自invitrogen公司，RNA提取试剂购自Invitrogen公司，RT-PCR试剂盒购自Takara公司。

1.2制备方法

1.2.1利用PCR扩增attBl-CD4-attB2反应体系为5×Primer STARTM Buffer（Mg²⁺Plus）10μl，dNTPMixture（10μm）4μl，引物-F（10 μm）1μl，引物-R（10 μm）1μl，模板DNA 1μl，Primer STARTM HSDNA Polymerase 0.5μl，ddH20加至总体积50μl。扩增程序：98℃3 min，98℃10 s，60℃10 s，72℃60 s共30个循环，72℃5 min；最后6×loading buffer终止反应。用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，DNA琼脂糖凝胶电泳回收参照QIAquick的琼脂糖凝胶电-泳回收试剂盒，20℃冰箱保存。

1.2.2构建pDown-CD4，pUP-Promoter、pTail-IRES/CCR5 25℃，BP反应3 h（反应体系为attB₁-CD4-attB₂100ng，pDonr221/pDonrP4P1r/pDonrP2rP3100ng，BP clonase 1μl，TE buffer up to 5μl）；加入蛋白酶K终止反应（10 min，37℃）；转化BP反应产物到大肠杆菌Stb13；菌落PCR筛选阳性克隆（PCR反应体系：10×Taq Buffer with（NH₄）₂SO₄3μl，dNTP Mixture（10μm）3μl，MgCl₂2μl，引物-F（10μm）1.2μl，引物-R（10μl）1.2 μl，TaqDNApolymerase 1.5μl，模板DNA 2μl，ddH₂O 16.1μl，总体积为30μl。PCR扩增程序：94℃3 min，94℃30 s，60℃30 s，72℃1min共29个循环，72℃1 min；挑取阳性克隆质粒；送交阳性克隆测序。

1.2.3构建重组病毒质粒PLA.ExBi.P/puro-CMV-CD4-IRES-CCR5小量提取质粒pDown-CD4和骨架载体，25℃，LR反应3 h；反应体系为pUP-CMV12.89 ng，pDown-CD4 10.42 ng，pTail-IRES/CCR513.03 ng，骨架载体60.28 ng，LR clonase 1μl，TEbuffer up to 5μl；加入蛋白酶K终止反应10 min；转化LR反应产物到Stbl3；菌落PCR筛选阳性克隆；挑取阳性克隆质粒；送交阳性克隆测序。

1.2.4基于293T细胞的慢病毒包装 在5ml离心管先加入1-5 ml无血清Opti-MEMI培养液，再加入pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5、目的质粒（各4μg），轻轻颠倒混匀；另取1支无菌的5 ml离心管，加入1.5ml无血清Opti-MEMI培养液和40μl的Lipofeetamine 2000，轻轻颠倒混匀。室温孵育5min；将已稀释DNA加入到含有Lipofeetamine 2000的无血清Opti-MEM I培养液中，轻轻颠倒混匀。室温孵育20min，制备获得DNA-Lipofeetamine 2000复合物。将复合物添加到293FT细胞中过夜培养，转染后24h，更换10 ml含10%血清DMEM培养液。转染后48 h、72 h收集培养上清进行浓缩，分装好的病毒放置80℃保存。

1.2.5 293T细胞中mRNA的qRT-PCR检测 取对数生长期的293T细胞，置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5%CO₂的培养箱中培养。当细胞融合率达50%左右，加入慢病毒载体，传代培养。7 d后收集细胞用Trizol法提取总RNA，参照潞蜕明书进行逆转录合成cDNA，以逆转录所得到的cDNA为模板进行RT-PCR。引物序列为：CD4（上游引物：5-TGCCTCAGTATGCTGGCTCT-3，下游引物：5GAGACCTTrGCCTCCTTGTrC-3）；CCR5f上游引物：5-GCTGGTCATCCTCATCCTGATAA-3'，下游引物：5'-ATGGCCAGGTrGAGCAGGTA-3）和GAPDH（上游引物：5一TrCACCACCATGGAGAAGGC-3，下游引物：5-GGCATGGACTGTGGTCATGA-31。通过ABI7500实时荧光定量PCR仪进行检测，反应程序为：95℃1 min，94℃15 s，60℃1 min，40个循环。

1.2.6 L615细胞的慢病毒转染及HIV-1感染取对数生长期的小鼠白血病细胞L615，置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5%CO₂的培养箱中培养。当细胞融合率达50%左右，加入慢病毒载体，传代培养。3 d后收集细胞用Trizol法提取总RNA，参照试剂说明书进行逆转录合成eDNA，以逆转录所得的eDNA为模板进行RT-PCR。7 d后，L615细胞感染HIV-1，收集2、4、6 h上清液提取RNA，进行qRT-PCR检测。

1.3统计学分析

采用SPSS 18.0统计学软件，实验数据以x±s表示，两组之间的比较用独立样本t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1菌落PCR鉴定hCD4/CCR5

重组质粒puro-CMV-CD4-IRES-CCR5菌落PCR鉴定结果如图1所示，可见2个阳性条带，根据设计的引物，目的片段CD4和CCR5的理论大小约为193和75 bp，与其相符，表明CD4和CCR5皆为阳性克隆。空载体（Mock-Vector）Pgk-puro为空白对照。

2.2 PLA.ExBi.P/puro-CMV-CD4-IRES-CCR5全序列

重组质粒puro-CMV-CD4-IRES-CCR5载体的全序列测序结果见图2，显示所构建的慢病毒表达载体均含有所设计的目的片段，其序列与设计的puro-CMV-CD4-IRES-CCR5核苷酸序列完全一致，证实目的片段已正确插入PLA.ExBi.P慢病毒载体，成功构建了重组慢病毒载体。

2.3转染后293T细胞CD4/CCR5基因在mRNA水平的表达

提取转染后293T细胞中的RNA，进行逆转录，以cDNA为模板进行了qRT-PCR检测，结果如图3所示：与空的慢病毒载体（N-T）相比，CD4和CCR5mRNA水平的表达量显著增加（P<0.05）。

2.4转染L615细胞后的CD4/CCR5 mRNA表达及HIV-1感染检测结果

L615细胞转染慢病毒及进行HIV-1感染的结果如图4所示，图A为L615细胞感染慢病毒载体第3、5、7天后qRT-PCR检测结果，其中T表示的是感染有表达hCD4/CCR5慢病毒的L615细胞，Control则是空载病毒对照，显示转染后3d、5d和7 d的hCD4和hCCR5的mRNA表达明显升高（P<0.05）。图B为转染后L615细胞被HIV-1感染后上清中qRT-PCR第2、4、6 h检测结果，其中T表示的是感染HIV-1的L615细胞，Control则是空载病毒对照组，显示HIV-1RNA转染后2、4、6 h表达显著下降，具有统计学意义（P<0.05）。

3讨论

CD4分子主要表达于辅助T（Th）细胞，是Th细胞TCR识别抗原的共受体（co-receptor），与MHCⅡ类分子的非多肽区结合，参与Th细胞TCR识别抗原的信号传导。同时，CD4分子也是HIV的主要受体。CCR5是细胞内β趋化因子[RANTES、（MIP-1）α/CCL3和（MIP-1）β/CCIA]的受体，具有调控T细胞和单核细胞/巨噬细胞系的迁移、增殖与免疫的功能，主要表达于记忆性的静止期T淋巴细胞、单核细胞、未成熟的树突状细胞等的细胞膜上，目前研究亦表明CCR5是HIV-1侵入機体细胞的主要辅助受体之一。HIV-1对宿主细胞具有高度选择性，仅能感染T4淋巴细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等，受体的限制就是其基本原因之一。基于此，为使非HIV-1宿主细胞可被病毒感染，需克服受体的限制。

慢病毒是一种逆转录病毒，它可以将外源的DNA插入到感染细胞的基因组中，有实验发现慢病毒载体转染细胞后比其他逆转录病毒的致癌性低。与腺病毒载体相比，腺病毒载体携带的目的基因不能整合到宿主细胞的基因组中，在传代的细胞中容易将基因信息丢失，同时一些腺病毒基因产物也会引起细胞凋亡。本实验选用了慢病毒进行载体构建，首先，加入了REV元件，因为最近的研究表明骨架中含有REV反应元件（RRE）能提高外源基因的表达率，REV元件的存在能使基因组在插入载体时抑制异常连接；其次，将WPRE元件插入在慢病毒载体序列中，WPRE已被证明可以稳定转录从而增强了转基因的表达，加入WPRE元件后，在生产病毒颗粒时能够增加病毒的滴度；第三，CMV作为CD4-IRES-CCR5的启动子和IRES双启动子作用，CMV作为启动子不仅能使病毒的滴度提高，而且可以使基因的表达水平增加，能使其在不同类型的细胞中感染效率加强。

本实验应用Gateway技术，构建重组质粒PLA.ExBi.P/puro-CMV-CD4-IRES-CCR5，将构建好的质粒载体进行了Ndel/BamHI双酶切鉴定和核苷酸测序分析，结果表明hCD4和hCCR5均正确地插入到了质粒载体中。为了检测慢病毒包装后hCD4/CCR5的表达情况，采用qRT-PCR检测了小鼠白血病细胞L615中hCD4和hCCR5基因在mRNA水平的表达情况，实验结果表明，与空的慢病毒载体相比，表达hCD4/CCR5分子的慢病毒载体的hCD4/CCR5基因在mRNA水平的表达量相当高，这表明基于表达hCD4/CCR5分子的慢病毒载体是可以成功转染鼠类细胞的。随后，转染后L615细胞进行HIV-1感染，随着感染时间的延长，上清中HIVRNA表达量有显著下降，这表明HIV-1病毒顺利地入胞于小鼠白血病细胞L615中。也就是说，应用本研究所构建慢病毒载体，转染后L615细胞可成功表达hCD4及hCCR5分子，促成了鼠类细胞对HIV-1的入胞感染，作为一种构建HIV跨物种细胞模型的转基因工具，对HIV/AIDS的发病机制、抗病毒研究具有积极的意义。