回补维生素E对维生素E缺乏不孕大鼠妊娠结局的影响

郎楠，贺斌，王丽丽，王介东*

(1.北京协和医学院研究生院，北京　100730；2. 国家卫生计生委科学技术研究所，北京　100081)



回补维生素E对维生素E缺乏不孕大鼠妊娠结局的影响

郎楠1，2，贺斌2，王丽丽1，2，王介东1，2*

(1.北京协和医学院研究生院，北京100730；2. 国家卫生计生委科学技术研究所，北京100081)

【摘要】目的研究在植入过程回补维生素E对维生素E缺乏不孕(VED)大鼠妊娠结局的影响。方法从出生后11 d开始喂养维生素E缺乏的食物，喂养6个月后建立VED大鼠模型。在模型大鼠交配后5.5 d、6.5 d、7.5 d分别灌胃500 mg/kg的维生素E回补，以非VED大鼠为对照组，在回补0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h和24 h观察维生素E的浓度变化，并于交配后19.5 d统计大鼠子宫的着床点个数、活胎个数和胎鼠体重变化。结果VED大鼠在回补4 h后血浆中维生素E的浓度为13.54±3.81 μg/ml，达到正常水平；分别在交配后5.5 d、6.5 d、7.5 d 回补维生素E的VED大鼠妊娠率分别为80%、60%、40%(对照组均为100%)，着床点个数分别为9.3±1.1、8.5±0.5和8.4±1.4(对照组为12.7±0.5、13.0±2.2和12.7±1.2)，活胎个数分别为5.0±2.0、4.0±2.3和2.0±2.4(对照组为12.3±0.5、12.7±2.4和11.3±1.7)，均显著低于对照组(P<0.05)；交配后5.5 d回补组胎鼠体重与对照组相比无统计学差异(P>0.05)，交配后6.5 d和7.5 d回补组胎鼠体重显著低于对照组(分别为1.74±0.55 g和1.63±0.68 g vs. 2.16±0.18 g和2.19±0.21 g)(P<0.01)。结论在植入过程回补维生素E可部分挽救由于维生素E缺乏所导致的不孕;随着回补时间的延后，回补维生素E对妊娠结局挽救的效果明显下降。

【关键词】维生素E；妊娠结局；植入

(JReprodMed2016，25(1)：61-66)

Evans等[1]在上世纪20年代发现缺乏维生素E可以导致大鼠不孕。维生素E是一类妊娠过程不可或缺的营养元素，缺乏维生素E会引起早产、流产、先兆子痫和胎儿子宫内生长受限[2-4]。维生素E在体内的减少是一个非常缓慢的过程，建立维生素E缺乏的动物模型需要很长的时间[5]。研究维生素E最常用的动物是大鼠。维生素E缺乏导致不孕的雌性大鼠卵巢和排卵过程没有受到影响，但在妊娠过程中出现吸收胎；而雄性大鼠的精子发生过程异常，导致精子减少或无精[6]。维生素E的研究一直主要围绕生殖过程，但维生素E在妊娠过程中的作用阶段及相关分子机制还不清楚，需要进一步研究探讨。本研究以维生素E缺乏的不孕大鼠为研究对象，探究植入过程中回补维生素E对其妊娠结局的影响。

材料与方法

一、材料

1. 实验动物：SPF级Wista幼鼠鼠龄为出生后10 d，共10窝，每窝10只；SPF级Wista雄鼠9～10周龄，共20只，购自北京协和医学院实验动物中心。光周期调控：06：00～18：00光照，18：00～06：00黑暗，恒温(21±1)℃、恒湿(55%±5%)条件下饲养，自由取食饮水。

2. 饲料配制及维生素E检测：饲料委托北京维通利华实验动物技术有限公司加工合成，经第三方检测机构北京谱尼测试科技有限公司测试，正常饲料中维生素E含量是154 mg/kg，维生素E缺乏饲料中维生素E的含量<0.5 mg/kg。

正常饲料配方(%)：酪蛋白20，蛋氨酸0.3，葡萄糖67.5，猪油5(Corn Oil，tocopherol-stripped替代)，纤维素3，矿物盐3.5，碳酸钙0.35，复合维生素0.35。

维生素E缺乏饲料配方(%)：酪蛋白20，蛋氨酸0.3，葡萄糖67.5，猪油5(Corn Oil，tocopherol-stripped替代)，纤维素3，矿物盐3.5，碳酸钙0.35，复合维生素(缺维生素E)0.35[7]。

(天然型)维生素E软胶囊(100 mg/粒，浙江医药股份有限公司新昌制药厂)。

维生素E检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)

二、方法

1. 建立维生素E缺乏大鼠不孕模型：仔鼠出生后第11天开始给母鼠分别喂养正常饲料(对照组)和维生素E缺乏饲料(VED饲料组)，并对仔鼠进行称重，每周称重一次；第21天离乳后，两组中的雌性仔鼠继续喂养相应的正常饲料和维生素E缺乏饲料，观察生长过程中体重的变化；喂养24周后，两组雌鼠与正常的雄鼠进行第一轮交配。在16：00将雌鼠和雄鼠放在交配笼里，次日8：00在交配笼下的托盘中看到阴栓，为交配成功，记为0.5 d。其中，交配成功没有产下仔鼠的VED饲料组雌鼠定义为维生素E缺乏不孕大鼠(VED组)。

2. 维生素E回补实验：对照组和VED组大鼠分别进行第二轮交配。在16：00将雌鼠和正常雄鼠放入交配笼中，次日8：00见阴栓为交配成功，记为0.5 d，进行以下处理：(1)对照组和VED不孕组孕鼠各随机留取15只，分别在5.5 d、6.5 d和7.5 d(5只/d)处死，收集子宫角，计数着床点数目；(2)余下的VED不孕组孕鼠分别在5.5 d、6.5 d和7.5 d补充维生素E(500 mg/kg，灌胃)，每个时间点5只，称为VED-E组；对照组孕鼠同期以1 ml无菌玉米油灌胃，称为C-C组。灌胃时记为0小时(0 h)，在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h和24 h尾静脉取血，EDTA抗凝保存；在19.5 d处死孕鼠，收集孕鼠子宫角，计数子宫着床点(含吸收胎)和活胎数量，记录胎鼠体重。

3. 血浆中维生素E的测定：静脉血抗凝混匀放置后，3 500 r/min离心10 min，放入-70℃保存。使用维生素E检测试剂盒进行维生素E浓度的测定。采用分光光度法，以联苯菲啰啉为显色剂，在波长533 nm处测定吸光度，浓度以μg/ml表示[8]。

三、统计学分析

实验结果采用SPSS 20.0软件进行分析。数据结果以平均值±SD表示，采用单因素方差分析，计量资料使用t检验，计数资料使用χ2检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、建立维生素E缺乏大鼠不孕模型

VED饲料组在喂养一周后，仔鼠体重比对照组少6.5 g，体重的差距随着喂养时间的延长逐渐拉大，至18周VED饲料组仔鼠体重逐渐接近对照组仔鼠，喂养21周后两组大鼠体重在240 g左右，无明显差异(P>0.05)。

喂养24周后进行第一轮交配，观察大鼠的妊娠情况。对照组产仔数为10.62±1.8只/窝；VED饲料组雌鼠见栓33只，仅有3只孕鼠产仔(窝仔数分别是3只、9只和10只，未纳入第2轮交配)，余下的30只见栓雌鼠均未见有产仔，即为维生素E缺乏不孕大鼠(VED组)。

二、回补维生素E对血浆维生素浓度的影响

C-C组维生素E浓度维持在11.77～13.54 μg/ml；VED-E组在回补维生素E 4 h后，维生素E浓度迅速由0.09±0.18 μg/ml升高至13.54±3.81 μg/ml，12 h时达到高峰，显著高于C-C组(P<0.05)，24 h时回落至15.69±2.53 μg/ml，与C-C组无统计学差异(P>0.05)。显示500 mg/kg的维生素E回补剂量可以达到正常生理水平(表1、图1)。

三、回补维生素E对妊娠结局的影响

交配后5.5 d、6.5 d和7.5 d时子宫着床点检查显示，对照组(C组)的着床点分别为12.7±0.5、13.0±2.2、12.7±1.2，VED组的着床点个数分别为9.2±1.1、8.8±0.8、8.7±1.3，均显著低于对照组(P<0.05)(图2)，提示维生素E缺乏可影响胚胎着床。

表1回补维生素E后不同时间点血浆中维生素E的浓度变化(x-±s，μg/ml)

组 别回补维生素E后的时间(h)04812162024C-C12.31±2.1813.54±1.9112.31±2.0813.00±1.7011.77±1.5112.77±1.4611.85±1.75VED-E0.09±0.1813.54±3.8118.12±0.35*21.31±1.51*19.46±1.32*17.08±1.80*15.69±2.53

注：与C-C组比较，*P<0.05

与C-C组比较，*P<0.05图1　回补维生素E后24 h内血浆维生素E的浓度

与对照组(C组)比较，*P<0.05图2　未回补维生素E的VED大鼠着床点数

回补维生素E后19.5 d时，在3个回补时间组(5.5 d、6.5 d和7.5 d)，C-C组的妊娠率均为100%，而VED-E组妊娠率分别为80%，60%和40%；C-C组的着床点分别为12.9±0.8、12.6±1.2、13±1.5，VED-E组着床点(含吸收胎)个数分别为9.3±1.1、8.5±0.5、8.4±1. 4，仍显著低于C-C组(P<0.05)(图3)，但与未回补维生素E的VED组相比无统计学差异(P>0.05)。提示在5.5～7.5 d回补维生素E不能有效改善胚胎着床。

VED-E组不同回补时间亚组的活胎数分别为5.0±2.0、4.0±2.3、2.0±2.4，显著低于C-C组(分别为12.3±0.5、12.7±2.4、11.3±1.7)(P<0.05)(图4)。提示5.5～7.5 d回补维生素E可部分挽救胚胎发育；6.5 d和7.5 d回补维生素E后的VED-E组胎鼠体重与C-C组相比明显减轻(1.74±0.55 g、1.63±0.68 g vs. 2.16±0.18 g、2.19±0.21 g)(P<0.01)，且6.5 d和7.5 d时回补维生素E比5.5 d回补维生素E的胎鼠体重显著下降(P<0.01)(图5)。同时，VED-E组在不同时间点回补维生素E的妊娠率、活胎数量的结果也提示，随着回补时间的延后，其补救效果逐渐减弱。

讨论

维生素E是一类脂溶性的营养元素，参与整个生殖过程，尤其是早期妊娠过程[9]。维生素E和其它维生素不同，至今尚未发现维生素E的受体，维生素E如何进入细胞以及通过什么途径起作用无从下手研究[10]。有研究发现维生素E降低卵泡内的氧化压与维持胚胎正常生长、胎盘形成/建立以及胎盘血管新生过程密切相关，但其作用机制尚不清楚[11-13]。

与C-C组比较，*P<0.05图3　不同时间回补维生素E后孕19.5 d时大鼠着床点数

与C-C组比较，*P<0.01图4　不同时间回补维生素E后孕19.5 d时活胎数量

与C-C组比较，*P<0.01；与5.5 d比较，# P<0.01图5　不同时间回补维生素E后孕19.5 d时胎鼠体重

维生素E不能在人体中合成，主要通过外源性补充。通过胆汁和胰液作用，维生素E嵌合到微胶粒中，经非饱和的被动扩散方式被肠上皮细胞吸收[14]。大多数乳糜微滴通过受体介导的内吞作用被肝脏吸收。在肝细胞中维生素E结合到α-tocopherol transfer protein(α-TTP，一种维生素E的转移蛋白)上，α-TTP介导维生素E转移到极低密度脂蛋白上，从而使维生素E进入血液循环[14]。不能被吸收的维生素E通过胆汁排出体外或通过细胞色素P450介导的ω-氧化途径形成α-2-(2-羧乙基)羟基苯并二氢吡喃(α-CEHC)，α-CEHC通过尿液排出体外[14]。维生素C-维生素E循环通过氧化还原作用重新合成维生素E，导致维生素E在体内的消耗是一个非常缓慢的过程。因此本研究从11天龄的仔鼠开始缺乏维生素E，妊娠试验验证并建立了维生素E缺乏大鼠的不孕模型。人类口服维生素E会导致血浆中维生素E浓度差异性地增加，而这种个体差异是由维生素E的活性、代谢速率、脂质的成分和含量、循环的维生素E的状态和体内环境条件引起的[15]。本实验中回补维生素E后大鼠血浆中维生素E的浓度显著性增加，标准差适中，没有发现维生素E浓度的个体差异变化。本研究一次性给予VED组大鼠200 mg维生素E，回补4 h即显著提高血浆维生素E浓度，12 h达到高峰并开始回落，24 h时与对照组没有统计学差异，表明外源性维生素E能快速有效补充体内维生素E。给维生素E缺乏大鼠回补200 mg维生素E，换算到人体中是800 mg，即1 200 IU，而≤1 600 IU的维生素E对于人体内正常氧化压是安全的[16-17]。因此，我们回补的维生素E对于大鼠来说是安全有效的。

维生素E缺乏不孕模型大鼠(VED组)和模型大鼠回补维生素E(VED-E组)的着床点个数比对照组少(P<0.05)，这说明长期维生素E的缺乏影响大鼠的着床，可能是因为维生素E影响卵或子宫肌层的运动，卵到子宫植入部位的运动不均衡导致着床点个数的减少[18]。大鼠的植入时间是在交配后5.5～6.0 d，而回补维生素E的时间是交配后5.5 d、6.5 d和7.5 d，此时子宫已经为植入做好了准备，因此VED组和VED-E组着床点个数上没有统计学差异。维生素E缺乏虽然影响大鼠的着床，但是VED组和VED-E组还是有大约9个的着床点，提示维生素E对着床点的影响不是维生素E缺乏导致大鼠不孕的主要原因。

本研究发现，回补维生素E后VED-E组的妊娠率、活胎数有所恢复，但显著低于只灌注溶剂的正常对照组(C-C组)，且随着回补时间的延后，其补救效果逐渐减弱，说明交配后5.5～7.5 d回补维生素E只能部分挽救不孕，提示维生素E缺乏对胚胎生长发育过程具有重要影响。Evans等[6]研究结果显示，断奶后开始持续缺乏维生素E的成年不孕大鼠，在交配后5 d或6 d回补胚芽油(富含维生素E)可以产下活的仔鼠，也支持这一结果。α-TTP敲除后小鼠不孕提示维生素E对胎盘形成是必需的，影响胎盘的迷路区域[19]。胎盘形成过程中，快速的代谢要求组织具有强抗活性氧(ROS)能力，维生素E是主要的抗氧化剂之一，可能通过抵抗ROS而在维持胎盘的正常功能中发挥重要作用。但是α-TTP基因敲除小鼠补充α-生育酚能够完全挽救妊娠结局[19]，与本研究中回补维生素E后可以部分挽救妊娠结局并不完全一致。有研究显示大鼠喂食维生素E缺乏饲料12周，可导致肝脏α-TTP蛋白表达显著降低，但高剂量维生素E并不能促使α-TTP蛋白表达增加[20]，提示维生素E对α-TTP的调控机制可能是两者挽救结果差异的原因之一。有关维生素E和α-TTP的相互作用仍有待于深入研究。

通过维生素E的回补实验，我们了解了维生素E影响植入过程并影响胚胎的生长发育。建议对妊娠早期孕妇可适当补充维生素E，以满足胚胎生长发育的需要。

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[编辑:罗宏志]

The effect of vitamin E supplement on the pregnancy outcomes of vitamin E-deficiency-associated infertile female rat

LANGNan1，2，HEBin2，WANGLi-li1，2，WANGJie-dong1，2*

1.GraduateSchool，PekingUnionMedicalCollege，Beijing100730

2.NationalResearchInstituteforFamilyPlanning，Beijing100081

【Abstract】

Objectives： To study the effect of vitamin E (VE) supplement during the implantation process on pregnancy outcome of VE deficiency-associated infertile female rat.

Methods： Female rats were on VE-deficient diet to establish the VE deficiency-associated infertility model (VED group). The model rats (VED group) were given VE (500 mg/kg) by intragastric administration on 5.5，6.5 and 7.5 days post-coitum (dpc) respectively，with the non-VED rat (on normal diet) supplemented with vehicle as control. Plasma VE levels were determined at 0 h，4 h，8 h，12 h，16 h，20 h and 24 h after supplement. The pregnancy outcomes were determined on 19.5 dpc，with number of implantation sites，live fetus and weight of fetus examined.

Results： Plasma VE levels in VED group reached the normal levels at 4 h after VE supplement. The pregnancy rates in VED group with VE supplement at 3 diferent time-points (subgroups 5.5，6.5 and 7.5 dpc) were 80%，60% and 40% respectively (100% in control)，the number of implantation sites were 9.3±1.1，8.5±0.5 and 8.4±1.4 respectively (in control，12.7±0.5，13.0±2.2 and 12.7±1.2)，and the number of live fetus were 5.0±2.0，4.0±2.3 and 2.0±2.4 respectively (in control，12.3±0.5，12.7±2.4 and 11.3±1.7). There was a significant difference in all observed parameters between VED group and control group at all subgroups (P<0.05). Compared with that in control group，fetus weight was significantly reduced in VED group with VE supplement at 6.5，7.5 dpc (1.74±0.55 g，1.63±0.68 g vs. 2.16±0.18 g，2.19±0.21 g) (P<0.01)，while no significant difference was found between VED subgroup of 5.5 dpc supplement and normal control(P>0.05).

Conclusion： VE supplement during the implantation process can partially rescue the infertility caused by VE deficiency in rat. The efficacy of rescue was getting lower with the time delayed.

Key words：Vitamin E；Pregnancy outcome；Implantation

【作者简介】郎楠，女，河南南阳人，博士，细胞生物学.(*通讯作者)

【基金项目】科技部十二五支撑计划 (No.2012BAI31B06)

【收稿日期】2015-10-15；【修回日期】2015-11-25

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.1.012