肺炎支原体对大环内酯类抗生素耐药性及耐药机制研究

冯真英 叶少玲 陈文兴 姚小军

肺炎支原体对大环内酯类抗生素耐药性及耐药机制研究

冯真英 叶少玲 陈文兴 姚小军

目的探析肺炎支原体对大环内酯类抗生素的耐药性及其耐药机制。方法130例社区获得性肺炎患者,取其急性期咽拭子标本,行肺炎支原体分离培养,采用聚合酶链反应(PCR)进行分离株分子鉴定；采用微量稀释法检测肺炎支原体对大环内酯类抗生素的最低抑菌浓度(MIC),行23SrRNA基因测序,并与标准菌株MPFH(ATCC 15531)基因序列进行对比分析。结果130例社区获得性肺炎患者咽拭子标本中,分离出20株(15.4%)肺炎支原体；对大环内酯类抗生素药物均存在耐药性,其耐药机制为23SrRNA基因位点突变。结论肺炎支原体对大环内酯类抗菌药物具有严重的耐药性,其耐药机制主要是23SrRNA基因位点突变。

肺炎支原体；大环内酯类抗生素；最低抑菌浓度；耐药

肺炎支原体(MP)是临床小儿呼吸道感染的常见病原体,其引发的肺炎和肺外并发症严重危害患者的健康和生命。因此,探寻最佳的治疗方案具有重要的临床意义。临床治疗肺炎支原体感染多以大环内酯类抗生素较为常见［1］,但近些年,大环内酯类抗生素长期广泛的临床应用,已有报道表明肺炎支原体耐药株的产生,同时药物自身的不良反应,使临床治疗效果欠佳［2］。本次研究探讨肺炎支原体对大环内酯类抗生素的耐药性及其耐药机制,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本院2013年6月～2015年8月收治的社区获得性肺炎患者130例,其中男68例、女62例,年龄15～78岁,平均年龄(47.2±11.5)岁。入选标准：符合中华医学会呼吸病学会制定的成年人《社区获得性肺炎诊断和治疗指南》关于肺炎的诊断标准［2］：患者年龄≥14周岁,X线或CT检查显示肺部出现新浸润影,且符合①新出现的咳嗽症状加重；②体温＞37.8℃或＜35.6℃；③外周白细胞总数＞10×109/L或＜4× 109/L的三者之一。排除标准：①免疫抑制性疾病或已接受免疫抑制剂治疗者；②发病时间＞1周；③孕妇或哺乳期；④90 d内有住院史且住院时间＞2 d；患者均签署知情同意书。

1.2 采集标本 患者入院后当日,采集其急性期咽拭子,置于肺炎支原体保存液的无菌保存管中,冻存于-80℃送检。

1.3 肺炎支原体培养 采用变色培养基液体培养法,以基础肉汤培养基、培养添加剂自配的变色培养基,取200 µl置入咽拭子标本液中,加入2ml变色培养基中,于37℃温度下培养2～6周,颜色由澄清红变为澄清黄判定为阳性［3］,反之为阴性；对获得培养阳性菌株行MP-PCR鉴定。

1.4 药敏试验 采用SP4液体培养基,以微量稀释法检测肺炎支原体对红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、米诺环素、四环素、加替沙星、莫西沙星、环丙沙星、左氧氟沙星的MIC。采用PCR法扩增检测肺炎支原体23SrRNA全序列,并与标准菌株MPFH (ATCC 15531)基因序列对比。

2 结果

2.1 肺炎支原体分离率 130例咽拭子标本中,共分离出20株(15.4%)肺炎支原体,均行PCR法鉴定。

2.2 肺炎支原体对抗菌药物的敏感性 20株肺炎支原体对大环内酯类抗生素均存在耐药性,耐药率为100%,其耐药机制为23SrRNA基因位点突变；四环素、氟喹诺酮类未见耐药株；喹诺酮类中加替沙星、莫西沙星存在着良好的体外抗肺炎支原体活性,其MIC值显著低于环丙沙星、左氧氟沙星。肺炎支原体药物敏感试验结果见表1,表2。

表1 20株肺炎支原体体外药物敏感试验的MIC值(µg/ml)

表2 20株肺炎支原体体外药物敏感试验的MIC值(µg/ml)

3 讨论

MP是临床呼吸道感染的常见病原体,对大环内酯类抗生素较为敏感。近些年,肺炎支原体的耐药现象逐渐增多,且有研究报道显示,已分离出对大环内酯类抗生素的耐药菌株,而其耐药的主要机制为23SrRNA基因突变。大环内酯类抗生素是临床放线菌属细菌的次级代谢产物［4］,结构特征以14～16元环大环内酯为母核,糖苷键和1～3分子糖相连接,其中红霉素是14元环大环内酯的代表性药物,另还有克拉霉素、竹桃霉素等；阿奇霉素是15元环大环内酯类代表药物；大环内酯类抗生素的抗菌机制为蛋白合成抑制剂,对核糖体有共同的结合位点,可抑制核糖体上的蛋白质合成。

大量临床研究显示,病原体细胞中核糖体的23SrRNA含有肽酰转移酶,能催化肽键的合成,进而合成蛋白质；大环内酯类抗生素则能与酶的催化中心Ⅴ区的核苷酸相作用,抑制细菌蛋白质的合成。多聚肽链合成的肽转移酶中心A2058位是红霉素作用的关键位点,其作用基团与各基因相结合,并分别形成氢键。另有研究表明［5］,大环内酯类抗菌药物还可抑制病原体50S核糖体的组装,进而抑制细菌蛋白质的合成。由于肺炎支原体分离培养的难度较大,对其耐药机制的研究主要由抗生素体外诱导的耐药株、临床分离株中获得。目前,研究认为大环内酯类抗生素的灭活机制为：①靶位的改变,如基因突变或甲基化；②主动外排；③药物的灭活。而结合位点的基因突变是引起肺炎支原体耐药的主要机制之一。

人工体外诱导获得的耐药株的耐药机制主要是23SrRNA基因突变。早前有学者研究发现,红霉素诱导获得的两株耐药菌株中有2063位由A到G点突变,有2064位A到G点突变；其中2063位点突变的菌株耐药表型为14元环的大环内酯类耐药,2064位点突变的菌株耐药表型为16元环的大环内酯类耐药［6］。另有学者报道显示：体外红霉素诱导的耐药菌株存在2063位A到G和2064位A到G的点突变,诱导药物的浓度与突变模式无关,其耐药表型主要取决于点突变的部位［3］。上述突变都在23SrRNA的Ⅴ区,而其他大环内酯类抗生素的作用位点未发现有点突变,23SrRNA的Ⅱ区也未发现点突变。本次研究结果显示：130例社区获得性肺炎患者咽拭子标本中,分离出20株(15.4%)肺炎支原体；对大环内酯类抗生素药物均存在耐药性,耐药率高达100%,而其耐药机制为23SrRNA基因位点突变。

综上所述,肺炎支原体对大环内酯类抗菌药物具有严重的耐药性,其耐药机制主要是23SrRNA基因位点突变。而近些年,随着检测技术的进步发展,新型耐药机制有待进一探讨研究。

［1］韩旭,辛德莉,马少杰,等.耐药肺炎支原体肺炎患儿的临床特点.实用儿科临床杂志,2010,25(16):48-49.

［2］朱翠明,刘艳,刘丹.突变敏感性分子开关检测肺炎支原体对大环内酯类抗生素的耐药性研究.中国人兽共患病学报,2015,31(5):73-74.

［3］胡荆江,陈玲,覃军.儿童肺炎支原体突变体对大环内酯类药物耐药的研究.国际呼吸杂志,2015,35(19):17-18.

［4］史大伟,辛德莉.肺炎支原体体外诱导抗生素耐药及其机制.国际儿科学杂志,2010,37(1):86-87.

［5］吴勇兵,王瑞琼,张畅斌,等.96例小儿肺炎支原体感染情况及耐药性分析.国际医药卫生导报,2012,18(13):74-75.

［6］黄榕,阳爱梅,宋建辉,等.1026例儿童肺炎支原体感染及耐药情况分析.中国当代儿科杂志,2013,15(7):26-27.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.13.096

2016-04-06］

524003 湛江市第二人民医院(冯真英 叶少玲陈文兴)；第二军医大学研究生四队(姚小军)