第细胞水平的肝脏纤维化力学研究

李晶 刘玉兰



第细胞水平的肝脏纤维化力学研究

李晶 刘玉兰

疾病情况下肝脏的物理特性与患者的照护和处置方式有着密切的联系。通常可通过触诊来评价肝脏的硬度(肝脏纤维化程度的代表指标)，这也是我们教会医学生评估肝脏情况体格检查的重要一课。临床实践中有很多用于评估肝脏硬度的影像学手段，众多研究也表明，肝脏的硬度和临床表现有明确的相关性，肝脏越硬，肝脏发生硬化和肝细胞功能异常以及肝细胞癌的可能性就越大[1-2]。尽管在临床上已经有这样的认识，在基础研究层面，肝脏硬度和其病理学之间的联系尚无系统的探讨。现有研究发现，当肝脏基质增加时可以激活肝脏的星状细胞(HSC)分化，但对于肝脏基质硬度增加与肝细胞功能障碍之间的关系知之甚少。Desai等[3]的研究明确提示，基质的硬度而非其浓度、结构或成分造成肝细胞的去分化从而影响了其生理功能。更重要的是，这项研究同时也填补了目前关于肝脏硬度如何影响肝细胞功能这一知识领域的空白，即肝脏硬度的增加可以直接减少肝核因子4α(HNF4α)这一在肝脏细胞分化过程中至关重要的转录因子的表达。这项研究有着非常重要的临床意义：即肝脏硬度的增加的过程中发生了肝细胞的去分化，这在一定程度上揭示了肝硬化时肝功能异常及肿瘤形成的潜在机制。此外，粘着斑激酶(FAK)和Rho/Rho激酶(ROCK)信号通路参与了此过程，提示针对FAK和ROCK的抑制剂有可能改善纤维化状态的肝脏功能。

Desai等的研究也有助于我们理解肝脏的物理特性。通过影像学检查以及针对移植物和体外动物肝脏的研究，总结了“大体”肝脏的物理特点——肝脏硬度是上述所有组织总和的硬度[4]，而Desai等在小鼠的肝脏中进行了微米级别的精细研究。使用原子力显微镜(AFM)详细描绘了正常和纤维化小鼠肝脏中央静脉、汇管区、两区之间水平和垂直的纤维间隔等的力学特点。这种研究手段既往已用于证实小鼠肺纤维化硬度大于正常肺，而且通常表现为局部硬度显著增加。

Desai等发现，正常的肝脏在力学上呈现异质性的特点，肝脏实质异质性与其解剖学的相关性目前尚不清楚，其力学特性在一定程度上反应了肝细胞索、Disse间隙和单层内皮细胞等存在硬度的差别。与预想一致的是，门脉区比中央静脉区硬度高。这些硬度差异很轻微且并没有达到明显的统计学差异，但Desai等的研究提示，即使是非常轻微的硬度差别，也有可能对肝细胞等细胞的生物学行为和功能产生巨大影响。细胞本身是问题的关键。本研究强调了细胞对环境硬度变化的压力感受，并强调了肝脏不同区域的肝细胞暴露在具有不同力学特性的基质微环境中。对于基质力学特点的异质性如何影响正常生理情况下肝细胞的生物学行为目前尚有待于进一步的研究，肝脏不同分区中基质力学的差别可以部分解释不同分区中肝细胞功能、可溶物的表达以及对损伤易感性的差别。本研究指出，在理解肝细胞功能分区时应将肝脏不同分区的基质力学特性纳入考虑之中。

当发生了肝脏纤维化之后，不同分区的肝脏实质细胞环境的力学异质性更加突出[3]。本研究使用AFM和高分辨率光学显微镜观察了发生了纤维化的肝脏硬化局部的特殊结构。引起研究者兴趣的问题是：窦周毛细血管化，代表了早期纤维化过程，是否可以影响局部力学特性并通过力学特性的改变影响局部肝细胞和新生基底膜上血窦内皮细胞的功能。

发生胆管纤维化时，肝脏整体的硬度增加最为明显。与这一观点类似，通过AFM手段研究发现，尽管两种动物模型的肝脏间质中均有纤维间隔形成，3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢-2,4,6-三甲基吡啶(DDC)诱导的伴有胆管损伤的小鼠肝硬化模型的肝脏硬度是CCl4模型的两倍。除了早期纤维化阶段外，上述模型对肝细胞的影响并不大，这两种动物模型肝脏中几乎纤维瘢痕形成的全部区域内压力均超过了1 kPa，这种肝细胞所处环境的硬度的改变对肝细胞功能的影响趋于平稳状态。而肝星状细胞，至少在培养环境下，对环境硬度感受比肝细胞更敏感，可发生纤维化、凋亡等，这也意味着不同区域的HSC表达了不同的蛋白酶。这对于纤维化的逆转有重要的意义，也解释了为什么会出现部分纤维间隔周围细胞缺失，相对于其他非胆管瘢痕结构而言，胆管瘢痕硬度更高、更难降解。是否在纤维化进程中存在纤维间隔力学层面的“不可逆点”？这个问题的答案将对于我们在将来定义人类肝硬化的特定“硬度”具有重大意义并有助于我们理解肌成纤维细胞可产生蛋白酶和最易诱导凋亡的硬度范围。部分学者认为，纤维化进程中胶原的含量变化不大，但胶原的组分发生变化使其更加分散，大的纤维变为小片段并插入肝细胞之间[5]。这一过程中局部的力学改变是怎样的？肝细胞在此过程中又将发生怎样的反应？

Desai等使用AFM对上述问题的解答有部分提示。首先他们的工作为肝脏不同状态下精确的力学特性提供了大量的信息。在小鼠模型中描绘了终末期硬化时、病毒性、胆源性以及脂肪性等不同基质组分状态下肝脏不同分区的硬度特点，这为我们理解纤维化如何形成、肝细胞功能异常以及潜在的可逆过程提供了关键信息。他们的工作也为我们理解硬化基础上肝细胞癌(HCC)的发生提供了部分线索。若与Desai等观察到的一致，即在肝脏基质硬度增加时肝细胞的增殖增加，则提示在肝脏中存在特定的硬度区域或特殊的力学/结构区域，这将为HCC的形成提供一个合适的微环境或一次亦或二次打击。最后，通过分析不同时间点肝脏的高分辨硬度变化将有可能揭示肝脏早期修复的力学变化，同时也可能帮助我们理解肝脏结构例如桥接纤维化形成中的力学变化。Desai等这项研究在回答了许多科学问题的同时也揭开了肝脏的力学特性这一新的研究领域的全新篇章。

[1] Tatsumi A, Maekawa S, Sato M, et al. Liver stiffness measurement for risk assessment of hepatocellular carcinoma. Hepatol Res, 2015,45:523-532.

[2] Singh S, Fujii LL, Murad MH, et al. Liver stiffness is associated with risk of decompensation,liver cancer, and death in patients with chronic liver diseases: a systematic review and meta-analysis. Clin Gastroenterol Hepatol, 2013,11:1573-1584.e1-2; quiz, e88-89.

[3] Desai SS, Tung JC, Zhou VX, et al. Physiological ranges of matrix rigidity modulate primary mouse hepatocyte function in part through hepatocyte nuclear factor 4 alpha. Hepatology,2016,64:261-275.

[4] Perepelyuk M, Chin L, Cao X, et al. Normal and fibrotic rat livers demonstrate shear strain softening and compression stiffening: a model for soft tissue mechanics. PLoS One,2016,11:e0146588.

[5] Popov Y, Sverdlov DY, Sharma AK, et al. Tissue transglutaminase does not affect fibrotic matrix stability or regression of liver fibrosis in mice. Gastroenterology， 2011,140:1642-1652.

(本文编辑：张苗)

100000 北京大学人民医院消化内科

2016-09-24)