兔膝OA腔内注射牛膝多糖对软骨细胞凋亡的影响

邱芸 姜勇 梅芳

【摘 要】 目的：探讨关节腔内注射牛膝多糖液对骨性关节炎软骨细胞凋亡率的影响。方法：造模成功后，实验兔左侧膝关节腔内注射牛膝多糖液0.4ml，右侧膝关节内注入玻璃酸钠0.4ml，每周1次，共4次。于0、15、30d各处死12只实验兔，观察软骨细胞凋亡及凋亡率。结果：治疗前各组细胞凋亡率比较无明显差异（P>0.05）；治疗第15天各组与治疗前比较差异均有统计学意义（P<0.05），两组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；治疗第30天各组与治疗前比较差异均具有统计学意义（P<0.05），两组间差异有统计学意义（P<0.05）。结论：牛膝多糖能够更好的促进骨性关节炎修复，具有很好的临床价值。

【关键词】 牛膝多糖；膝骨关节炎；软骨细胞；凋亡率

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）22-0014-02

骨关节炎是一种退行性骨关节病，以关节软骨退变及软骨下骨变化为主要特征[1]。骨关节炎发生以膝、髋部最为常见，且在60岁以上中老年人群的膝骨关节炎发病率高达49%[2]。研究分析关节腔内注射牛膝多糖液对玻璃酸钠骨性关节炎软骨细胞凋亡率的影响，探讨牛膝多糖对骨性关节炎的作用，为临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康6～8月龄新西兰雄性大白兔36只，体重2.0kg左右，由南昌大学医学院动物科学部提供。动物合格证号：江西医动证字第04106-01号，SPF级。

1.1.2 仪器与试剂 XYS-13型荧光显微镜（上海上光新光学科技有限公司）；CCK-8-1000T型细胞周期与凋亡试剂盒（上海歌凡生物科技有限公司）。

1.1.3 药品 中药怀牛膝（江西中医药高等专科学校附属医院中药房提供并鉴定）。粉碎过目，放入多功能提取罐，先加入蒸馏水400 L提取2次，药物残渣再加蒸馏水300L提取2次；提取液合并浓缩，然后加入3倍量乙醇进行纯化，得白色沉淀物，沉淀经干燥得牛膝多糖粗提物，进一步使用乙醇纯化，得牛膝多糖纯化物；将纯化物配成相当生药4 g的水溶液放冰箱备用。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 动物进行左右侧造模膝骨性关节炎，左膝为治疗组，右膝为对照组。

1.2.2 造模 采用改良Hulth模型造模，取符合要求的36只雄性新西兰白兔，用3%戊巴比妥钠以30mg/g剂量对动物耳缘静脉注射麻醉，固定于手术台上，双膝关节局部脱毛，备皮，消毒，关节内侧进行长4cm左右纵切口，切断内侧副韧带，摘除内侧半月板，切断前交叉韧带，保留后交叉韧带，保护软骨面，彻底止血，清理缝合及固定。术后1周内每天强迫动物进行30min超疲劳活动，共观察3个月。然后进行X线观察显示有明显的关节腔狭窄及骨刺形成，以获得骨性关节炎模型[3]。

1.2.3 给药 造模成功后的第1天，实验左侧膝关节腔内注射治疗物牛膝多糖液0.4ml，右侧膝关节内注入对照药物玻璃酸钠0.4ml，每周1次，共4次。实验的第0、15、30天分别处死12只试验兔，取材后进行软骨细胞凋亡观察，并观察动物的日常总体状况，测量体重，并作相关记录。

1.2.4 观察指标及方法 将关节软骨组织冰冻切片后，用4%多聚甲醛溶液在室温下固定20min，然后加入细胞通透液（0.1%TritonX-100+0.1%枸橼酸钠）后加入PBS液洗2次，擦片后加入50μl TUNEL反应混合液，在37℃温箱内加盖孵育60min，PBS洗3次后，置于荧光显微镜下观察（见图1），有荧光显色者可确认为具有细胞凋亡特征。放大400倍进行观察，以100个软骨细胞为单位，计算凋亡的数目统计细胞凋亡率。平均每切片观察5个视野，统计其平均凋亡率。

1.3 统计学方法 数据采用SPSS11.0统计软件分析，计量资料以均数加减标准差（x±s）表示，采用t检验，P<0.05表示差异有统计意义。

2 结果

治疗前兔软骨细胞凋亡率差异不具有统计学意义（P>0.05）；治疗第15天各组与治疗前比较差异均具有统计学意义（P<0.05），但治疗组间差异无统计学意义（P>0.05），说明牛膝多糖与玻璃酸钠治疗兔膝骨关节炎都有效，两者效果无明显区别。治疗第30天与治疗前比较差异均具有统计学意义（P<0.05），且治疗组间比较差异具有统计学意义（P<0.01），说明牛膝多糖与玻璃酸钠治疗效果有明显区别，且牛膝多糖优于玻璃酸钠。见表1、图1。

3 讨论

《本草纲目》记载牛膝“苦、酸，平，无毒。治…伤折。牛膝乃足厥阴、少阴药。所主之病，大抵得酒则能补肝肾，生则能去恶血”。《本经》称其“治寒湿痿痹，四肢拘挛，膝痛不可屈伸，逐血气，…久服轻身耐老”。牛膝多糖是牛膝中含量较高的活性成分，药理研究证明，牛膝多糖在调节免疫、抗衰老等[4]方面活性显著。张利等[5]运用补肾活血汤治疗膝骨性关节，显示补肾活血汤（包括牛膝）对膝关节骨性关节炎引起的关节疼痛有明显的疗效；陈元娜[6]研究发现川牛膝多糖高剂量组有促进细胞免疫、体液免疫及非特异性免疫功能的作用，表明牛膝多糖具有一定增强免疫功能的作用。另外，牛膝多糖对糖尿病大鼠视网膜病变具有保护作用[7]；牛膝对重型颅脑损伤大鼠神经干细胞的再生有促进作用[8]。

骨性关节炎（Osteoarthritis，OA）严重程度和软骨细胞凋亡数量之间存在着重要的相关性[9]，OA中凋亡软骨细胞的比例增高，说明在0A中细胞凋亡的确在发挥作用[10]。本实验研究结果显示牛膝多糖对兔OA软骨细胞凋亡有正向调节的作用，可以减少细胞的凋亡率，这可能是牛膝多糖能够促进骨性关节炎修复的机制，说明牛膝多糖对于防治OA具有很好的临床应用价值。

参考文献

[1]Zamli Z，Sharif M.Chondrocyte apoptosis：a cause or consequence of osteoarthritis [J].Int J Rheum Dis，2011，14（2）：159.

[2]何永淮，孙剑.车涛，等.二号敷药外敷治疗膝骨性关节炎60例的临床研究[J].现代生物医学进展，201l，1（4）：745.

[3]熊元，赵振国，李传郡，等.兔膝骨关节炎模型的制备及鉴定[J].实验动物科学，2013，30（3）：31-35.

[4]李金贵，谷文英，刘传敏，等.牛膝多糖对环磷酰胺致小鼠免疫抑制作用的影响[J].中国兽医杂志，2011，46（4）：24-26.

[5]张利，寇久社，张鸿，等.补肾活血汤治疗膝骨性关节炎疗效观察[J].陕西中医，2012，33（8）：1002-1003.

[6]陈元娜，徐锦龙，陈武，等.川牛膝多糖对小鼠免疫功能影响的实验研究[J].海峡药学，2012，24（6）：17-18.

[7]杨旭东，张杰，包海花.牛膝多糖对糖尿病大鼠视网膜细胞凋亡的影响[J].中国中医眼科杂志，2011，21（1）：8-10.

[8]韦相兰，黄李平，李凯，等.怀牛膝对重型颅脑损伤大鼠脑组织Nestin表达的影响[J].四川医药，2011，29（5）：59-61.

[9]Hashimoto S，Nishiyama T，Hayashi S，et al.Role of p53 in human chondrocyte apoptosis in response to shear strain [J].Arthritis Rheum，2009，60（8）：2340-2349.

[10]Carame s B，Taniguchi N，Otsuki S，et al.Autophagy is a protective mechanism in normal cartilage，and its agingrelated loss is linked with Cell death and osteoarthritis [J].Arthritis Rheum，2010，62（3）：791-801.

（收稿日期：2015.08.06）