产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌耐药机制及流行病学研究进展*

陈绍淳 综述，张 娟 审校

(汕头大学医学院第一附属医院检验科,广东汕头 515000)



·综 述·

产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌耐药机制及流行病学研究进展*

陈绍淳 综述，张 娟△审校

(汕头大学医学院第一附属医院检验科,广东汕头 515000)

肺炎克雷伯菌； 碳青霉烯酶； 耐药机制； 流行病学

自2009年报道产NDM-1的肠杆菌后，“超级细菌”这一概念为公众所熟知，这一类耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌常表现为多重耐药菌(MDR)，甚至泛耐药菌(PDR)，对几乎所有β-内酰胺类抗生素耐药，并使酶抑制剂(克拉维酸等)失效，使临床治疗陷入被动。肠杆菌主要耐药机制为产碳青霉烯酶，水解β-内酰胺类抗生素而表现耐药性状。肺炎克雷伯菌(CPKP)常见于人体呼吸道、消化道，是一种条件致病的肠杆菌科细菌，临床检出率高。近年来产碳青霉烯酶类CPKP报道日渐增多，尽管总体上检出率并不高(除了南亚大陆，均<7%)[1-2]。但CPKP已在世界多地出现暴发流行，同时也有在自然环境中发现CPKP的报道[3]。表明其播散趋势不容乐观，研究CPKP的耐药机制及其流行病学规律，对此类感染的防控具有重要意义。

1 耐药机制

碳青霉烯酶是一类能广谱水解β-内酰胺环的水解酶。可以使含有β-内酰胺环的抗生素失效。是CRKP最常见的耐药机制。编码酶的基因既可位于基因组DNA上，也可位于质粒上，因为水平基因转移元件的存在，可以对各种耐药基因进行整合，并通过质粒进行传播，使耐药基因的传播跨越生殖隔离，耐药性更加具有传播性。根据Ambler分子分类法，可以把碳青霉烯酶分为A、D、B 3类。

1.1 A类碳青霉烯酶 A类碳青霉烯酶是一类丝氨酸蛋白酶，包括KPC、IMI、SME、GES、NMC、SHV 6种。其中NMC、IMI和SME位于染色体上，而KPC、GES则常见于质粒上，其余染色体和质粒均可见。此类碳青霉烯酶可水解包括碳青霉烯类、头孢菌素类、青霉素类和氨曲南。

对于CPKP，以KPC酶最为常见。KPC族酶自1996年于美国第1次报道以来，已经发现KPC-1至KPC-11 11种亚型[4]。KPC酶对β-内酰胺类抗生素水解能力强，应用β-内酰胺酶抑制剂(克拉维酸等)对其效果不佳。有报道称应用3倍药物浓度的美罗培南、替加环素和克林霉素可以提高产KPC酶的CPKP感染患者生存率[5]。但对于这种用药组合是否会对患者带来不良反应，持续使用高浓度的碳青霉烯类药物是否会进一步推高CPKP的最小抑菌浓度(MIC)值等问题有待进一步研究。KPC酶常位于IncA/C型和IncFIIK+FIBK型质粒的Tn4401转座子上，该质粒具有宿主种类多、分布范围广的特点，更加速了KPC基因的传播。KPC基因最初在相邻的地域间传播，自美国第1次报道，现已经在亚洲、欧洲、中东地区普遍报道[6]。以往认为CPKP多为院内感染常见的普通型，极少对身体健康的人致病，近期中国大陆地区发现了携带KPC-2基因的荚膜K1型高致病性CPKP，此类病原菌对人有强致病性，高致病性的CPKP感染会给临床用药带来很大挑战[7]。

相对于KPC，其他几种A类碳青霉烯酶报道较少，位于染色体上NMC、IMI和SME其扩散能力较差，并未呈现大规模流行的趋势。GES属于弱水解性的碳青霉烯酶，很多单表达GES的菌表现型常为对碳青霉烯类抗生素敏感性降低或者中介，根据耐药性初筛易导致漏检，在GES家族中，GES-5基因的水解能力最强，最初于韩国报道此酶在CPKP中的存在[8]。

1.2 B类碳青霉烯酶 B类碳青霉烯酶属于金属酶类，包括NDM、IMP、VIM、GIM、SPM。与其他两类不同，其活性位点上包含金属离子，对亚胺培南、厄他培南等常见碳青霉烯类抗生素有很强的水解活性。多位于可接合质粒上，并与整合子、插入序列等可移动性基因元件结合，使其具有很强的传播能力[9]。金属酶活性可被乙二胺四乙酸(EDTA)所抑制，据此原理，亚胺培南药敏纸片添加0.5 mmol/L的EDTA制成的组合纸片和单纯亚胺培南纸片联合应用可用于检测肠杆菌科的金属酶表型。

B类酶中检出率呈现地域分布特点，其中NDM酶自2009年在印度新德里检出并因此得名，成为南亚地区检出率最高的B类碳青霉烯酶，在印度某些城市，检出率甚至超过60%，并且成为重要的输出地区[10-11]。其最常见NDM-1型，多次在该地区暴发流行，现在携带NDM酶的CPKP在中国、韩国、日本等东亚国家检出率也呈逐年升高。中国上海报道1次产NDM-1型的CPKP在新生儿科的暴发流行[12]。同时在欧洲、美洲大陆等与南亚并无接壤的地区也相继报道，欧洲表达NDM-1酶的CPKP报道，多为输入性病例，其余NDM型报道较少，西班牙、菲律宾相继发现携带NDM-7型基因的CPKP，较于NDM-1，NDM-7型酶对碳青霉烯类水解效率更高，应引起重视。VIM和IMP酶的水解效率更高，其多在欧洲及美洲大陆出现流行[13-14]。希腊发现携带VIM-19的CPKP，并确认为本土案例，所幸的是，VIM和IMP酶检出率并不高，其并未如NDM型酶迅速扩散。

1.3 D类碳青霉烯酶 D类碳青霉烯酶是一类苯唑西林酶，多位于染色体上，目前已发现超过400种OXA家族基因，其中232种对常见碳青霉烯类抗生素均有低水解活性，且不被克拉维酸等β-内酰胺酶抑制剂抑制[15]。多见于鲍曼不动杆菌，CPKP偶见报道，主要为OXA-48型[16]。产OXA-48型酶的CPKP常见于土耳其、约旦、伊朗等中东、中亚地区报道，欧洲病例多以输入性病例为主，一项法国的研究表明，纳入研究的病例中，53%的OXA-48阳性CPKP感染患者均有国外旅游史[17]。近期西班牙的相关研究发现，携带OXA-245的CPKP[18]。与其他几种广泛报道的碳青霉烯酶一样，OXA也常与各种基因元件结合，并通过基因元件在不同菌株之间扩散。对一株分离自土耳其的OXA-48携带的CPKP的研究表明，其位于可接合的质粒上，但并未与Ⅰ类整合子相结合[19]。携带OXA基因的CPKP常在用药后出现耐药性增强，据Lunha等[20]研究，当携带OXA-48酶的CPKP孔蛋白Ompk36变异时，或合并表达其他碳青霉烯酶时，可表现出较原来更高水平的耐药，这也是此类CRKP治疗过程中耐药性变化的主要原因。

2 产碳青霉烯酶的CPKP流行病学研究

2.1 分型技术的研究进展 克隆分型技术可以了解特定时间、空间内细菌的分布情况，追踪其传播途径，并通过分析不同克隆型之间情缘关系远近来研究其演变规律。目前，用于细菌分型的技术主要有多位点序列分型(MLST)、脉冲电场凝胶电泳(PFGE)、利用随机引物的肠杆菌基因间共有多重序列的ERIC-PCR分型和全基因组测序分型技术。其中PFGE技术具有分辨率高的特点，是公认的细菌分型的金标准[21]。但操作繁琐耗时，且目前尚未形成通用的标准化操作，各实验室之间的分型结果可重复性差；ERIC-PCR法简便易行，但分辨率较低[22]；全基因组测序精度高，方便易行但其高昂费用阻碍了大规模应用，MLST技术是基于全球菌株数据库[23]。通过菌株比对进行分型，其优点在于可以与数据库中克隆型进行比对，分析其传播规律，由于是建立在比对基础上的技术，其不足之处在于数据库中没有的克隆型无法进行分析，但随着提交新克隆型的研究者增多，MLST的数据库也正趋于完善，其在研究细菌传播、演变上的价值愈加受到研究者的重视。

2.2 CPKP的MLST数据研究 把本地区的临床菌株与MLST数据库进行比对，可以了解本地区流行的主要克隆型，克隆型的流行同样具有地域分布特性。由于KPC、NDM这两型碳青霉烯酶传播广，受到关注高，以下主要介绍这两型碳青霉烯酶携带菌株的克隆型流行情况。

由于KPC主要在CPKP上检出，MLST数据库中有记录的相关克隆型达57种，未计入数据库中的克隆型也呈多样性。携带KPC基因中ST258的CPKP占46.3%，系统发育树分析提示该型可能为携带KPC的CPKP的祖先型。通过全基因组测序技术，对ST258的CPKP分析表明，该克隆型已经成为美国医疗机构常见的克隆型[24]。随着KPC的扩散，越来越多的克隆型在各地发现，在保加利亚大学附属医院，ST15型的产KPC-2酶的CPKP是其主要克隆型[25]。意大利的瓦莱达奥斯塔地区CPKP主要流行ST101、ST1789、ST512和ST405这4种型[26]。这些报道表明KPC携带的菌株正在增加，表明KPC基因的扩散趋势不容乐观。

表达NDM酶的CPKP最初发现于南亚，在2009年在临床上第1次检出之前，已于2006年在印度新德里的自然水体中检出携带NDM-1基因的肠杆菌[3]，并发现其属于多个克隆型，表明早在NDM基因流行之前，在流行地环境中就已存在一个数量相当的种群，加之其与多种水平基因转移元件相结合[27]，具有播散能力强，短短几年间便在世界范围内扩散，但因发现时间较短，收入MLST数据库的产NDM型CPKP克隆型只有17个克隆型。但近年来发表的文献表明，携带NDM的CPKP克隆型正在不断增多，印证了此基因不断播散的趋势，在中国长沙报道了1次产NDM-1的CPKP暴发，其主要克隆型为ST17[28]。在希腊，报道了两次产NDM-1酶的ST11型CPKP暴发流行除了院内监测发现携带NDM基因的克隆型在增加，自然环境中的带有NDM基因的种群也在不断地发现，在西班牙，3所医院内流行的产NDM-7酶的CPKP同属ST437型，流行病学调查发现，此型CPKP在当地环境中属于优势种群，这也促成了此次流行[29-30]。这表明以往院内流行的产NDM的CPKP开始在当地环境中出现。

3 小 结

自从抗生素问世，抗生素与细菌的“军备竞赛”就愈演愈烈，随着碳青霉烯类抗生素应用广泛，细菌对其耐药率也逐年攀升，CPKP作为院内感染的常见菌种，表达碳青霉烯酶意味着其几乎对所有的β-内酰胺类抗生素耐药，加之各种水平基因转移元件的存在，使碳青霉烯酶耐药基因具有易于扩散的特点，使其可通过水平传播，扩散耐药基因，目前发现越来越多的产碳青霉烯酶的CPKP克隆型，意味着携带碳青霉烯酶基因的CPKP种群正在不断扩大，同时在多地自然环境中也发现种群数目可观的环境库，由此增加了相关菌株暴发流行的风险，给临床治疗带来极大挑战。

通过使用PCR等分子生物学技术对碳青霉烯酶耐药基因进行研究可以了解其耐药机制，对研制针对性的新型抗生素具有启迪意义，通过各种分型技术进行流行病学研究，有助于掌握各地CPKP的流行情况，研究其流行规律，并通过规范用药、加强院感监测等手段控制其流行。

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广东省高水平大学重点学科建设资助项目(2015049)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.034

A

1673-4130(2016)23-3328-03

2016-06-01

2016-08-21)

△通讯作者，E-mail:Juanzh005@126.com。