细胞致死性扩张毒素和外膜蛋白的结构功能和致病机制

孙菲　张建刚　肖水清

1.滨州医学院口腔学院正畸教研室　滨州 256603；2.济南市口腔医院正畸科　济南 250001

细胞致死性扩张毒素和外膜蛋白的结构功能和致病机制

孙菲1张建刚2肖水清2

1.滨州医学院口腔学院正畸教研室滨州 256603；2.济南市口腔医院正畸科济南 250001

伴放线放线杆菌是青少年牙周病的主要致病菌，与侵袭性牙周炎密切相关。伴放线放线杆菌细胞致死性扩张毒素（CDT）和外膜蛋白（OMP）等毒力因子使其更易定植到宿主体内，破坏宿主的免疫调节，从而进一步引起牙周组织破坏和加速牙周病的进展。本文主要就CDT和OMP毒力因子目前的结构功能及致病机制作一综述，以期对其深入研究有所帮助。

伴放线放线杆菌；细胞致死膨胀毒素；外膜蛋白

This study was supported by the Enterprise Innovation Project of Technology Division in Jinan（201121038）.

［Abstract］Actinobacillus actinomycetemcomitans（A.actinomycetemcomitans） is the main pathogenic bacteria of juvenile periodontal diseases and is associated with aggressive periodontitis. A.actinomycetemcomitans cells secrete synthetic cytolethal distending toxin（CDT） and outer membrane protein（OMP），which can be easily planted into the host to destroy immunity function. Thus，the presence of these molecules leads to the progression of periodontal tissue destruction and periodontal diseases. This paper mainly describes the structural function and pathogenic mechanism of the two virulence factors，namely，CDT and OMP，for further research.

［Key words］Actinobacillus actinomycetemcomitans；cytolethal distending toxin；outer membrance proteins

伴放线放线杆菌是一种兼性厌氧的革兰阴性球杆菌，是一种侵袭性牙周炎（aggressive periodontitis，AgP）重要的可疑致病菌，成为牙周炎细菌病因学中研究最多的细菌之一。伴放线放线杆菌可引起心内膜炎、骨髓炎、感染性关节炎、菌血症、败血症、肺炎和动脉粥样硬化等疾病［1-2］。伴放线放线杆菌可以产生细胞致死性扩张毒素（cytolethal distending toxin，CDT）、外膜蛋白（outer membrance proteins，OMP）、脂多糖、白细胞毒素、菌毛相关蛋白和胶原酶等多种毒力因子，这些毒力因子有利于细菌在宿主体内定植，破坏组织，抑制组织修复，干扰宿主免疫反应［3-5］。本文主要就伴放线放线杆菌CDT和OMP的结构功能、致病机制等研究进展作一综述，以期进一步了解伴放线放线杆菌的致病机制。

1　CDT

CDT可引起细胞膨胀，导致细胞周期阻滞，抑制细胞增殖，诱导淋巴细胞程序性死亡，影响宿主免疫，诱导细胞因子分泌等，在牙周病的发生发展中起至关重要的作用［5-6］。CDT由一系列与黏膜相关的革兰阴性细菌所产生［7］，这种毒素会影响慢性疾病中细菌与宿主免疫系统间的相互作用。伴放线放线杆菌是口腔中唯一携带cdt基因并表达Cdt蛋白的细菌［8］。

1.1CDT各亚基的结构和功能

CDT是由3个相邻基因cdtA、cdtB和cdtC编码的蛋白亚基CdtA（28 000）、CdtB（32 000）、CdtC（20 000）组成的异源三聚体全毒素，是一种热不稳定蛋白［3］。CDT的晶体结构是两个由CdtA、CdtB和CdtC构成的CDT异源三聚体通过CdtB 亚基之间的结合而形成的二聚体晶体结构［9］。

1.1.1CdtBCdtB与1型脱氧核糖核酸酶具有功能和结构的同源性，可以裂解DNA，最终导致程序性细胞死亡［10］。Shenker等［11］通过研究发现：CdtB具有磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸根磷酸酶3（phosphatidylinositol 3，4，5-triphosphate phosphatase 3，PI3，4，5P3）活性，导致某些类型细胞的周期阻滞和程序性死亡；而且只有PI3，4，5P3存在时，CdtB才具有磷酸酶活性；对CdtB磷酸酶活性相关位点进行突变，突变体的活性明显减弱。这就提示，磷酸酶活性也可能是CdtB的毒性机制之一。在CdtB的氨基酸序列中，核酸酶和磷酸酶的许多活性位点是重叠的，CdtB 的毒性机制既涉及核酸酶活性又涉及磷酸酶活性，究竟何者起主导作用尚不明确，仍需深入的研究［12］。

1.1.2CdtA和CdtCCdtA具有一个由多个芳香族氨基酸组成的特有的芳香斑区域［9］，将这些区域的氨基酸突变后，CdtA或CdtC的突变体与靶细胞表面的结合能力减弱，即这些区域可能是CDT毒素的受体结合区［10］。重组CDT全毒素的生物活性取决于其生物学功能的每个亚基在体外的变性和复性，从而使CdtA可发挥其黏附功能，以形成一个与CdtB和CdtC联合黏附在细胞表面以及转移CdtB 和CdtC进入细胞的功能全毒素［13-14］。半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）3可能是CDT在细胞膜上的受体，CDT与含GM3的脂质体共同孵育后，CDT对人单核细胞U937的毒性作用减弱［15］。

1.2CDT的致病机制

1.2.1细胞周期性阻滞完整的细胞周期存在4个检测位点，分别是G1/S期、S期、G2/M期以及M期检测点，当靶细胞的DNA在CDT作用下受到损伤时，细胞会不可逆地阻滞在G1、S或G2期而不能进入M期。共济失调毛细血管扩张症突变基因（ataxia telangiectasia mutant gene，ATM）编码的蛋白激酶磷酸化激活肿瘤抑制因子P53，从而上调细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂P21的表达，P21再抑制G1期或S期细胞周期调控蛋白的活性，使细胞阻滞在G1/S期。细胞周期依赖性激酶1水平下降，细胞分裂周期（cell division cycle，CDC）25C磷酸酶不发生磷酸化，使CDC25C磷酸酶失去活性，导致细胞阻滞在G2/M期［16］。碱性磷酸酶活性增高，易引起牙龈的局部炎症［17］。

1.2.2诱导程序性细胞死亡和破坏宿主的免疫系统CDT可通过诱导性一氧化氮合酶来抑制巨噬细胞合成一氧化氮，该机制也是CDT破坏宿主免疫反应的一个重要方面［18］。此外，诱导Cdt减少一氧化氮的生成，不仅会降低宿主控制感染的能力，而且还会干扰骨代谢［19］。检查点激酶（checkpoint kinase，CHK）2在CDT介导的牙龈上皮程序性细胞死亡中起重要的作用［16］。

1.2.3诱导细胞分泌表达致病因子CDT可促进牙周膜细胞合成白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和IL-8等多种炎症因子［20］。当宿主受到CDT刺激时，口腔牙龈上皮细胞会产生炎症因子IL-1β和IL-8［21］。CDT可以通过炎症受体核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族热蛋白结构域（nucleotidebinding oligomerization domain-like-receptor family pyrin domain，NLRP）3而诱导产生IL-1β，但与Cdt和Ltx的产生无关［22］。一些学者［23-24］认为，CDT可以增加中性粒细胞的渗透力，从而产生炎症递质和加快骨质破坏。

2　OMP

2.1OMP的结构

OMP是革兰阴性菌外膜的主要结构，占其全部组成的1/2，是细菌致病性的重要物质基础。伴放线放线杆菌主要的OMP有3种：孔蛋白、外膜A蛋白和脂蛋白（lipoprotein，Lpp）［25］。

2.1.1孔蛋白孔蛋白可以非共价键与肽聚糖紧密结合，可形成相对非特异性的细菌外膜上物质交换的通道，对疏水分子和大分子具有通透屏障的作用。OMP中的孔蛋白称之为TdeA，TdeA的中央通道是一个呈α-螺旋桶状域并且扩展到外胞基质中，β-桶状域嵌入外膜中，两种结构域均为独立状的折叠［26］。

2.1.2OMPAOMPA是革兰阴性伴放线放线杆菌OMP的主要成分，该蛋白质因丰富的β片层结构而被称为热修饰蛋白，主要作用是维持外膜的完整性［27］。OMP参与免疫的主要抗原是相对分子质量为1.7×104的肽聚糖相关Lpp（peptidoglycanassociated lipoprotein，PAL）。PAL既是一种OMP，又是一种Lpp，且与OMPA有相似性，PAL与口腔嗜血杆菌之间抗原的相互反应可能会促进牙周炎患者局部和全身免疫系统的反应。

2.1.3LppLpp是OMP中质量最多的蛋白质，具有稳定细菌外膜-肽聚糖复合体糖复合体的功能。缺少Lpp的变异株细菌细胞膜不稳定，形态为球形。Lpp没有作为噬菌体受体、结肠菌素受体的功能［25］。

2.2OMP的致病机制

2.2.1抗原性和免疫原性OMP100可使小鼠巨噬细胞产生炎性细胞因子，促进伴放线放线杆菌对口腔上皮细胞的定植和黏附。马来酸伊索拉定（Irsogladine maleate，IM）可抑制牙龈上皮细胞中OMP29所产生的IL-8的增长，进而保护细胞间的缝隙连接不受破坏。通过IM对IL-8水平的调控，可减少对细胞间隙连接的破坏。细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）可阻断OMP29诱导产生的IL-8的增长，表明OMP29激活ERK可增加IL-8。

2.2.2抑制宿主免疫应答伴放线放线杆菌在细菌生长期以可溶性的形式释放表面Fc受体。伴放线放线杆菌通过细菌特异性的Ig的Fab段与Fc段的桥联作用，发挥吞噬细胞吞噬细菌的作用。线放线杆菌细胞膜表面的Fc受体可干扰这种特异性的桥联作用，阻碍吞噬细胞对该细菌的吞噬作用。伴放线放线杆菌的Fc受体还可通过在补体经典活化途径中争夺与Ig的Fc受体结合，抑制补体活化或消除在可溶性阶段中的补体成分，阻碍补体裂解产物C3b与细菌的结合，妨碍吞噬细胞的吞噬作用，干扰宿主的免疫应答应答。

［1］Hu X，Stebbins CE. Dynamics and assembly of the cytolethal distending toxin［J］. Proteins，2006，65（4）：843-855.

［2］张玉杰，郭杨. 伴放线放线杆菌细胞致死性膨胀毒素研究进展［J］. 广东牙病防治，2011，19（10）：555-559. Zhang YJ，Guo Y. Research progress on Actinobacillus actinomycetemcomitans cytolethal distending toxin［J］. J Dent Prevent Treat，2011，19（10）：555-559.

［3］Shenker BJ，Besack D，McKay T，et al. Actinobacillus actinomycetemcomitans cytolethal distending toxin（Cdt）： evidence that the holotoxin is composed of three subunits： CdtA，CdtB，and CdtC［J］. J Immunol，2004，172（1）：410-417.

［4］朱绍平，张玉杰，肖水清. 104例牙周疾病患者口腔A.a感染情况及其与牙龈指数的关系［J］. 山东医药，2013，53（38）：89-90. Zhu SP，Zhang YJ，Xiao SQ. Oral infection status of A.a in 104 periodontal disease patients and its relationship with gingival index［J］. Shandong Med J，2013，53（38）：89-90.

［5］孙红钢，张玉杰，肖水清. 正畸过程中伴放线菌聚集杆菌的检测及其毒力因子细胞致死性膨胀毒素的研究［J］. 现代口腔医学杂志，2011，25（5）：355-358. Sun HG，Zhang YJ，Xiao SQ. Detection of Actinobacillus actinomycetemcomitans and research on virulence factor cytolethal distending toxin during orthodontic［J］. J Modern Stomatol，2011，25（5）：355-358.

［6］Boesze-Battaglia K，Brown A，Walker L，et al. Cytolethal distending toxin-induced cell cycle arrest of lymphocytes is dependent upon recognition and binding to cholesterol［J］. J Biol Chem，2009，284 （16）：10650-10658.

［7］Jinadasa RN，Bloom SE，Weiss RS，et al. Cytolethal distending toxin： a conserved bacterial genotoxin that blocks cell cycle progression，leading to apoptosis of a broad range of mammalian cell lineages ［J］. Microbiology，2011，157（Pt 7）：1851-1875.

［8］Yamano R，Ohara M，Nishikubo S，et al. Prevalence of cytolethal distending toxin production in periodontopathogenic bacteria［J］. J Clin Microbiol，2003，41（4）：1391-1398.

［9］Yamada T，Komoto J，Saiki K，et al. Variation of loop sequence alters stability of cytolethal distending toxin（CDT）： crystal structure of CDT from Actinobacillus actinomycetemcomitans［J］. Protein Sci，2006，15（2）：362-372.

［10］DiRienzo JM，Cao LE，Volgina A，et al. Functional and structural characterization of chimeras of a bacterial genotoxin and human typeⅠDNAse［J］.FEMS Microbiol Lett，2009（2）：222-231.

［11］Shenker BJ，Dlakic M，Walker LP，et al. A novel mode of action for a microbial-derived immunotoxin：the cytolethal distending toxin subunit B exhibits phosphatidylinositol 3，4，5-triphosphate phosphatase activity［J］. J Immunol，2007，178（8）：5099-5108.

［12］段君兰. 伴放线放线杆菌细胞致死性扩张毒素研究进展［J］. 牙体牙髓牙周病学杂志，2014，24（1）：48-51. Duan JL. Research advancement on Actinobacillus actinomycetemcomitans cytolethal distending toxin ［J］. Chin J Conserv Dent，2014，24（1）：48-51.

［13］Ando ES，De-Gennaro LA，Faveri M，et al. Immune response to cytolethal distending toxin of Aggregatibacter actinomycetemcomitans in periodontitis patients［J］. J Periodont Res，2010，45（4）：471-480.

［14］Eshraghi A，Maldonado-Arocho FJ，Gargi A，et al. Cytolethal distending toxin family members are differentially affected by alterations in host glycans and membrane cholesterol［J］. J Biol Chem，2010，285（24）：18199-18207.

［15］Mise K，Akifusa S，Watarai S，et al. Involvement of ganglioside GM3 in G（2）/M cell cycle arrest of human monocytic cells induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans cytolethal distending toxin ［J］. Infect Immun，2005，73（8）：4846-4852.

［16］Alaoui-El-Azher M，Mans JJ，Baker HV，et al. Role of the ATM-checkpoint kinase 2 pathway in CDT-mediated apoptosis of gingival epithelial cells［J］. PLoS ONE，2010，5（7）：e11714.

［17］王建宁，张玉杰，肖水清. 正畸对龈沟液中细菌微生态及碱性磷酸酶活性影响的研究［J］. 口腔医学，2011，31（9）：531-535. Wang JN，Zhang YJ，Xiao SQ. The changes of the bacterial ecology and ALP activity in gingival crevicular fluid during orthodontic treatment［J］. Stomatology，2011，31（9）：531-535.

［18］Fernandes KP，Mayer MP，Ando ES，et al. Inhibition of interferon-gamma-induced nitric oxide production in endotoxin-activated macrophages by cytolethal distending toxin［J］. Oral Microbiol Immunol，2008，23（5）：360-366.

［19］Herrera BS，Martins-Porto R，Maia-Dantas A，et al. iNOS-derived nitric oxide stimulates osteoclast activity and alveolar bone loss in ligature-induced periodontitis in rats［J］. J Periodontol，2011，82（11）：1608-1615.

［20］Akifusa S，Poole S，Lewthwaite J，et al. Recombinant Actinobacillus actinomycetemcomitans cytolethal distending toxin proteins are required to interact to inhibit human cell cycle progression and to stimulate human leukocyte cytokine synthesis［J］. Infect Immun，2001，69（9）：5925-5930.

［21］Umeda JE，Demuth DR，Ando ES，et al. Signaling transduction analysis in gingival epithelial cells after infection with Aggregatibacter actinomycetemcomitans［J］. Mol Oral Microbiol，2012，27（1）：23-33.

［22］Belibasakis GN，Johansson A. Aggregatibacter actinomycetemcomitans targets NLRP3 and NLRP6 inflammasome expression in human mononuclear leukocytes［J］. Cytokine，2012，59（1）：124-130.

［23］Bezerra Bde B，Andriankaja O，Kang J，et al. A. actinomycetemcomitans-induced periodontal disease promotes systemic and local responses in rat periodontium［J］. J Clin Periodontol，2012，39（4）：333-341.

［24］Kang J，de Brito Bezerra B，Pacios S，et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans infection enhances apoptosis in vivo through a caspase-3-dependent mechanism in experimental periodontitis［J］. Infect Immun，2012，80（6）：2247-2256.

［25］王楠，钟德钰. 伴放线放线杆菌外膜蛋白的研究进展［J］. 国际口腔医学杂志，2011，38（6）：730-733. Wang N，Zhong DY. Research progress on Actinobacillus actinomycetemcomitans outer membrane proteins［J］. Int J Stomatol，2011，38（6）：730-733.

［26］Kim S，Yum S，Jo WS，et al. Expression and biochemical characterization of the periplasmic domain of bacterial outer membrane porin TdeA［J］. J Microbiol Biotechnol，2008，18（5）：845-851.

［27］王楠，钟德钰，张晶，等. 伴放线放线杆菌粗糙株外膜蛋白的电泳分析［J］. 中国实用口腔科杂志，2009，2（11）：667-669. Wang N，Zhong DY，Zhang J，et al. Electrophoresis analysis of outer membrane proteins from Aggregatibacter actinomycetemcomitans rough strains［J］. Chin J Pract Stomatol，2009，2（11）：667-669.

（本文采编王晴）

Structural function and pathogenic mechanism of cytolethal distending toxin and outer membrane proteins

Sun Fei1，Zhang Jiangang2，Xiao Shuiqing2. （1. Dept. of Orthodontics，School of Stomatology，Binzhou Medical College，Binzhou 256603，China；2. Dept. of Orthodontics，Jinan Stomatological Hospital，Jinan 250001，China）

R 780.2

A

10.7518/gjkq.2016.05.016

2015-12-23；［修回日期］2016-06-15

济南市科技局企业创新计划（201121038）

孙菲，硕士，Email：sunfeijy@126.com

肖水清，教授，硕士，Email：shqxiao@126.com