冰片联合灯盏花素对缺氧/复氧损伤血脑屏障通透性的影响

徐露，张太君.重庆医科大学生化与分子药理学重点实验室，重庆 40006；.重庆市中医院，重庆 4000



冰片联合灯盏花素对缺氧/复氧损伤血脑屏障通透性的影响

徐露1，张太君2
1.重庆医科大学生化与分子药理学重点实验室，重庆 400016；2.重庆市中医院，重庆 400021

摘要：目的观察冰片联合灯盏花素对缺氧/复氧下血脑屏障（BBB）通透性的影响，探讨其保护BBB的作用机制。方法培养原代大鼠脑微血管内皮细胞（BMEC），在缺氧培养箱中缺氧2 h，再复氧24 h，建立单层BMEC体外BBB模型。实验分为正常对照组、模型组、冰片组、灯盏花素组、冰片＋灯盏花素组，各给药组给予相应药物干预，检测各组跨内皮细胞电阻（TEER）值和辣根过氧化物酶（HRP）的通透性，ELISA、Western blot检测BMEC中紧密连接蛋白ZO-1及Claudin-5蛋白表达。结果缺氧/复氧损伤导致TEER值降低，HRP通透率增加，ZO-1及Claudin-5蛋白表达降低；冰片联合灯盏花素可明显改善上述损伤。结论冰片联合灯盏花素对缺氧/复氧下BBB的损伤具有保护作用，其机制可能与上调ZO-1、Claudin-5蛋白表达有关。

关键词：冰片；灯盏花素；血脑屏障；大鼠

血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）是人体的一道重要生理屏障，主要作用是阻止某些有害物质进入脑组织，同时促进营养物质进入脑组织，BBB在保持脑组织内环境稳定方面起积极的作用。脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells，BMEC）是BBB的重要组成部分，其特殊的细胞膜转运系统和细胞间紧密连接，在中枢神经系统血管内外物质交换中起重要的作用。然而当脑组织受到炎症侵袭、缺血、缺氧损伤时，BMEC及其紧密连接的完整性遭到破坏，使BBB通透性增高，大量有害物质进入脑组织后加重脑神经血管损伤。

灯盏花素是临床常用的脑保护剂，能改善脑微循环、减轻脑组织损伤[1]。但灯盏花素水溶性较高，难以通过BBB，如能在脑组织中提高其药物浓度，疗效会更为明显。冰片是一种芳香开窍药物，有研究表明，冰片能抑制P-糖蛋白，协助其他难通过BBB的药物进入BBB[2]。本实验将冰片和灯盏花素联合用药，观察其对缺氧/复氧下BBB通透性的影响，探讨其保护BBB的作用机制。

1　实验材料

1.1动物

SPF级7日龄SD大鼠6只，体质量（30±5）g，雌雄不限，重庆医科大学实验动物中心，许可证号XCXK（渝）20090006，封闭且无菌条件下饲养。

1.2药物

灯盏花素（20 mg/支），湖南恒生制药有限公司，纯度≥95%，批号20131012，用生理盐水配制成1 mg/mL溶液备用；天然冰片，河南万博化工产品有限公司，纯度95%，批号A130916，用0.8%羧甲基纤维素钠配制成0.5 mg/mL混悬液备用。

1.3主要试剂与仪器

辣根过氧化物酶（HRP），Sigma公司；ELISA试剂盒、Western blot试剂盒、组织蛋白提取试剂、兔抗ZO-1单克隆抗体和小鼠抗Claudin-5单克隆抗体，Santa Cruz公司。Bio-Red酶标仪（美国Gene公司），跨内皮细胞电阻（TEER）仪（美国Millipore公司），凝胶成像系统（美国Thermo公司）。

2　实验方法

2.1脑微血管内皮细胞培养

参考文献[3]，将SD大鼠脱颈处死，75%酒精浸泡3～5 min进行消毒。快速取出全脑，置于预冷的D-Hank's液中，去除小脑、间脑、血管、脑膜等，保留皮质。用眼科剪将脑组织剪成约1 mm3碎片，再加0.7 mg/mLⅡ型胶原酶，37 ℃消化1 h，1000×g离心10 min，弃上清液，加20%BSA，1000×g离心20 min，保留底层沉淀。再加1 mg/mL胶原酶/分散酶，37 ℃消化1 h，700×g离心6 min，弃上清液，DMEM液漂洗2次，弃上清液，加DMEM培养液（20%胎牛血清FBS、2 mmol/L L-谷氨酸、30 µg/mL内皮细胞生长因子、100 µg/mL肝素钠）后，接种于75 cm2培养瓶中，2 d后换液，单层BMEC长成后融合70%～80%时传代。用消化液（0.25%胰酶和0.02%EDTA组成）消化，消化终止后用巴氏管轻轻吹打成细胞悬液，1000×g离心5 min，弃上清液，加DMEM培养液，接种于培养板中。

2.2分组、造模及给药

将培养的BMEC密度调至4×105/mL，吸取0.5 mL接种于Transwell板上，多聚酯细胞膜的细胞密度约为2×105/cm2，向Transwell板加1.5 mL完全培养基，37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养，2 d换液1次。待细胞融合时分为5组：正常对照组Transwell板全程正常孵育；模型组置于缺氧培养箱中2 h，再迅速置于正常培养箱中24 h；冰片组根据前期预实验及文献[4]，置于正常培养箱时加冰片使其终浓度为5 µmol/L；灯盏花素组根据前期的预实验，置于正常培养箱时加灯盏花素使其终浓度为10 µmol/L；冰片＋灯盏花素组置于正常培养箱时加冰片和灯盏花素使其终浓度分别为5 µmol/L和10 µmol/L。

2.3跨内皮细胞电阻值测定

待BMEC达到融合状态后，将电阻仪电极插入Transwell小室中，计算TEER值[（测得电阻值－基础电阻值）÷小室膜面积]，测量每组复氧24 h时TEER值。

2.4辣根过氧化物酶通透率测定

弃Transell板内培养基，在供体池中加含有500 ng HRP培养基，在受体池中加1150 µL相同培养基，使Transwell内外液面相平，于复氧后24 h从受体池中取样50 µL，向样品中各加50 µL四甲基联苯胺溶液和H2O2，显色10 min，加1 mol/L H2SO450 µL终止反应，于酶标仪450 nm处测定吸光度（A）值。另将10 ng/mL HRP溶液用无血清DMEM培养基等比稀释，按上述方法显色并测定A值，计算HRP通透率[（CHRP受体池×V受体池）÷（CHRP供体池×V供体池）× 100%][5]。

2.5ELISA检测ZO-1及Claudin-5蛋白表达

严格按照ZO-1及Claudin-5 ELISA试剂盒说明方法进行操作，于酶标仪450 nm处测定各组A值。

2.6Western blot检测ZO-1及Claudin-5蛋白表达

弃Transell板内培养基，用预冷浓度为0.01 mol/L 的PBS冲洗3次，加冰的裂解液，0 ℃放置30 min，再将细胞刮掉，离心后弃上清液，得到总蛋白。严格按照试剂盒说明操作，检测ZO-1及Claudin-5蛋白表达情况，所得条带用凝胶成像系统进行光密度扫描。

3　统计学方法

4　结果

4.1冰片联合灯盏花素对大鼠跨内皮细胞电阻值和辣根过氧化物酶通透率的影响

缺氧/复氧损伤可显著降低BBB的TEER值，增加HRP通透率，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，冰片组TEER值和HRP通透率均无明显差异（P＞0.05），灯盏花素组和冰片＋灯盏花素组TEER值明显升高，HRP通透率明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01），其中以冰片＋灯盏花素组效果更为显著。结果见表1。

表1　各组内皮细胞TEER值和HRP通透率比较（±s）

表1　各组内皮细胞TEER值和HRP通透率比较（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01（下同）

组别　n TEER值/（Ω/cm2）　HRP通透率/%正常对照组　10　40.05±3.16　0.61±0.08模型组　10　17.26±2.02**　2.09±0.21**冰片组　10　18.78±3.00**　1.89±0.21**灯盏花素组　10　31.59±4.27**##　1.34±0.23**##冰片＋灯盏花素组　10　35.74±5.34*##　1.14±0.16**##

4.2冰片联合灯盏花素对大鼠脑微血管内皮细胞ZO-1及Claudin-5蛋白表达的影响

与正常对照组比较，缺氧/复氧损伤后ZO-1及Claudin-5蛋白表达均显著降低（P＜0.01）；冰片组、灯盏花素组、冰片＋灯盏花素组均能显著上调ZO-1 及Claudin-5蛋白表达（P＜0.01），冰片＋灯盏花素组作用更为显著。结果见表2、表3、图1。

表2　ELISA检测各组内皮细胞ZO-1和Claudin-5蛋白表达比较（±s，A值）

表2　ELISA检测各组内皮细胞ZO-1和Claudin-5蛋白表达比较（±s，A值）

组别　n　　ZO-1　　Claudin-5正常对照组　10　0.41±0.02　0.35±0.03模型组　10　0.12±0.02**　0.10±0.04**冰片组　10　0.28±0.03**##　0.18±0.05**##灯盏花素组　10　0.30±0.04**##　0.25±0.03**##冰片＋灯盏花素组　10　0.36±0.02**##　0.33±0.03**##

表3　Western blot检测各组内皮细胞ZO-1和Claudin-5蛋白表达比较（±s）

表3　Western blot检测各组内皮细胞ZO-1和Claudin-5蛋白表达比较（±s）

组别　n　　ZO-1　　Claudin-5正常对照组　10　1.21±0.11　0.96±0.14模型组　10　0.22±0.10**　0.30±0.07**冰片组　10　0.37±0.07**##　0.39±0.09**灯盏花素组　10　0.61±0.08**##　0.46±0.07**##冰片＋灯盏花素组　10　0.85±0.09**##　0.76±0.08**##

图1　各组内皮细胞ZO-1及Claudin-5蛋白免疫印迹图

5　讨论

BMEC作为BBB形成的主要结构，它们之间形成的紧密连接是BBB主要的物质基础。当紧密连接蛋白的表达量、位置分布或结构功能等发生改变时，BMEC及其紧密连接的完整性遭到破坏，从而使BBB通透性增高，大量有害物质进入脑组织后加重脑神经血管损伤。作为与紧密连接密切相关的关键蛋白ZO-1 和Claudin-5蛋白更起着非常重要的作用。有研究表明，ZO-1缺失将会导致紧密连接结构遭到破坏[6]；Claudin-5表达下降也已被证明与血管通透性增加密切相关[7]。

本实验结果表明，单独使用冰片，其TEER值和HRP通透率与模型组比较并无显著差异，单用灯盏花素和冰片联合灯盏花素均可明显增加TEER值和降低HRP通透率，维持BBB的完整性，但冰片联合灯盏花素效果更为明显。ELISA和Western blot检测结果也显示，灯盏花素和冰片联合灯盏花素均可明显促进ZO-1和Claudin-5蛋白的表达。

综上所述，冰片联合灯盏花素对缺氧/复氧损伤BBB具有明显的保护作用，且与单用灯盏花素比较，联合用药可明显增强药理效应，根据Western blot、ELISA实验结果双重提示，其作用机制可能为上调ZO-1和Claudin-5蛋白的表达，维持BMEC及其紧密连接的完整性。

[1] 唐省三,马亚珍.灯盏花素注射液对大鼠脑缺血再灌注局灶性脑损伤的保护作用[J].中国临床康复,2005,9(29)：243-245.

[2] 朱国栋.冰片开放血脑屏障及通过P糖蛋白介导的机制研究[D].广州：广州医学院,2009.

[3] 郭虹,康立源,柴丽娟,等.灯盏细辛总咖啡酸酯对TNF-α诱导脑微血管内皮细胞ICAM-1表达的影响[J].辽宁中医杂志,2009,36(9)：1554-1556．

[4] 胡利民.冰片及配伍对血脑屏障通透性的影响和脑保护作用机制研究[D].天津：天津中医学院,2004.

[5] 李江辉,潘长旺,胡昕,等.血脑屏障细胞模型的构建[J].中国病原生物学杂志,2008,12(3)：894-896.

[6] YU H, WANG P, AN P, et al. Recombinant human angiopoietin-1 ameliorates the expressions of ZO-1, occludin, VE-cadherin, and PKCa signaling after focal cerebral ischemia/reperfusion in rats[J]. J Mol Neurosci,2012,46(1)：236-247.

[7] KIM J, CHAE Y K. Geomewide association studies of stroke[J].N Engl Med,2009,361(7)：722-723.

（修回日期：2015-06-10；编辑：华强）

·中药研究与开发·

Effects of Borneolum Syntheticum Combined with Breviscapine on Blood-brain BarrierPermeability Induced by Hypoxia/Reoxygenation Injury

XU Lu1, ZHANG Tai-jun2(1. Key Lab of Biochemical and Molecular Pharmacology, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China; 2. Chongqing City Hospital of Traditional Chinese Medicine, Chongqing 400021, China)

Abstract:Objective To observe effects of Borneolum Syntheticum combined with breviscapine on blood-brain barrier (BBB) permeability induced by hypoxia/reoxygenation injury. Methods The BBB model in vitro was established by primarily culturing brain microvascular endothelial cells (BMEC), hypoxia 2 h and reoxygenation 24 h. The experiment was divided into normal control group, model group, Borneolum Syntheticum group, breviscapine group, and Borneolum Syntheticum-breviscapine group. All treatment groups were given relevant medicine. TEER and HRP were detected; ELISA and Ｗestern blot was used to detect the expressions of ZO-1 and Claudin-5 in BMEC. Results Hypoxia/reoxygenation induced injury decreased TEER, increased permeability rate of HRP, and decreased the expressions of ZO-1 and Claudin-5; while Borneolum Syntheticum combined with breviscapine could improve damage caused by hypoxia/reoxygenation. Conclusion Borneolum Syntheticum combined with breviscapine shows obvious protective effect on BBB permeability induced by hypoxia/reoxygenation, and the mechanism is involved in the regulation of ZO-1 and Claudin-5 protein expressions.

Key words:Borneolum Syntheticum; breviscapine; blood-brain barrier; rats

收稿日期：（2015-05-14）

通讯作者：张太君，E-mail：4345422@qq.com

基金项目：重庆市自然科学基金（cstc2012jjA10137）

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

文章编号：1005-5304(2016)02-0076-03

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.021