急性低压缺氧脑损伤大鼠脑组织海马区HIF-1α时序性变化及意义

张文彬，苏畅，张永亮，李建宇，李灵芝

(1天津医科大学药学院，天津300070；2武警后勤学院)



急性低压缺氧脑损伤大鼠脑组织海马区HIF-1α时序性变化及意义

张文彬1，苏畅2，张永亮2，李建宇2，李灵芝2

(1天津医科大学药学院，天津300070；2武警后勤学院)

摘要：目的观察急性低压缺氧大鼠脑组织海马区缺氧诱导因子1α(HIF-1α)表达的时序性变化，探讨其与缺氧性脑损伤的关系。方法将100只成年雄性SD大鼠随机分为常氧对照组、低压缺氧6 h组、低压缺氧12 h组、低压缺氧18 h组和低压缺氧24 h组，每组20只。各低压缺氧组置于低压氧舱模拟海拔7 000 m高原环境。采用HE染色法观察各组脑组织海马区形态学改变，检测脑组织含水量，一氧化氮合酶(NOS)活性及NO含量，反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HIF-1α mRNA，免疫荧光化学染色法定位HIF-1α蛋白。结果①与常氧对照组比较，各低压缺氧组脑组织海马区神经细胞均有不同程度的水肿、坏死或凋亡，细胞质不规则红染，核仁碎裂或消失，且海马各区损伤程度不同，以CA1区最为严重；②与常氧对照组比较，各低压缺氧组脑组织含水量均显著上升(P均<0.01)，且随缺氧时间的延长呈递增趋势；③与常氧对照组比较，各低压缺氧组脑组织NOS活性均显著升高(P均<0.01)；除低压缺氧6 h组外，其余各组脑组织NO含量均随缺氧时间的延长而显著增加(P均<0.01)；④常氧对照组中未检测到HIF-1α mRNA表达，各低压缺氧组HIF-1α mRNA相对表达均显著增加，且具有时间依赖性(P<0.01或<0.05)；常氧对照组脑组织海马各区均未见HIF-1α蛋白阳性标记的绿色荧光，低压缺氧损伤后先在部分神经细胞胞质中出现微弱荧光信号，随着缺氧时间的延长荧光强度逐渐增强，并明显呈向胞核聚集的趋势。结论急性低压缺氧可导致脑含水量升高，引发脑水肿，且损伤程度随缺氧时间的延长而加重；HIF-1α的应激性表达对急性低压缺氧性脑损伤有保护性调控作用。

关键词：脑损伤；低压缺氧性；一氧化氮；一氧化氮合酶；脑水肿；缺氧诱导因子1α；大鼠

大脑是机体耗氧量最高的器官，对缺氧的耐受性极低，低压缺氧环境会引起大脑不可逆性损伤[1]。缺氧诱导因子1α(HIF-1α)是近年来缺氧相关领域的研究重点，其可通过调控红细胞生成素(EPO)及一氧化氮合酶(NOS)等多种靶基因调节缺氧反应[2~4]，但目前关于急性低压缺氧后脑组织海马各区的损伤情况、HIF-1α的表达定位及时序性变化鲜见报道。2015年2～9月，我们观察了急性低压缺氧大鼠模型脑组织海马各区在缺氧不同时间的损伤及HIF-1α表达情况，现分析结果，探讨HIF-1α调控与大鼠缺氧性脑损伤的关系。

1材料与方法

1.1材料实验动物：成年雄性SD大鼠(军事医学科学院实验动物中心)100只，清洁级，体质量280~320 g。 主要试剂与仪器：多聚甲醛(上海化学试剂公司)；考马斯亮蓝G250试剂盒、NOS试剂盒、NO试剂盒(南京建成生物工程公司)；兔抗大鼠HIF IgG单克隆抗体(santa cruz公司)；正常兔血清(北京中杉生物有限公司)；FITC标记的羊抗兔IgG(北京鼎国生物有限公司)；抗荧光衰减封片剂(北京applygen公司)；TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0试剂盒、DL-2000 Markers(宝生物工程有限公司)；TRIzol Reagent(美国invitrogen公司)。低压缺氧舱(烟台宏远氧业有限公司)；高速低温离心机、核酸定量仪(Eppendorf公司，德国)；超低温冰箱(Sanyo公司，日本)；组织切片机(Leica公司，德国)；E-510型多功能显微镜、激光共聚焦显微镜(Olympus公司，日本)；PCR仪(MJ Research公司，美国)。

1.2动物分组与造模采用随机数字表法将大鼠分为常氧对照组、低压缺氧6 h组、低压缺氧12 h组、低压缺氧18 h组和低压缺氧24 h组，每组20只。各组均饲养7天适应环境。各低压缺氧组进入低压缺氧舱进行低压缺氧，缺氧时间按实验要求；调节舱内压力在20 min内降至真空度-0.06 mPa(相当于海拔7 000 m大气压力)。实验过程中维持氧含量10%±2%，温度(20±3)℃，湿度65%±5%。实验结束20 min内使缺氧舱内升至正常气压。常氧对照组大鼠相同温、湿度于舱外正常饲养。

1.3相关指标观察

1.3.1海马区脑组织形态学变化4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定大鼠脑组织，取海马区组织石蜡包埋，连续切片，HE染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜下观察。

1.3.2脑含水量用滤纸吸干脑水分，取左半球用预先称重编号的锡纸包裹，称得湿重，150 ℃恒温烤箱中烘至恒重，冷却后称得干重，计算脑含水量。脑含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.3.3脑组织NOS活性及NO含量取上述右半球脑组织，按重量(g)∶体积(mL)=1∶9将脑与匀浆介质制成10%的匀浆，离心10 min(4 ℃、3 000 r/min)，吸取上清，以考马斯亮蓝法测定样品蛋白含量，按试剂盒说明书的方法检测样品NOS活性及NO含量。

1.3.4海马区HIF-1α mRNA表达采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法。取大鼠海马区脑组织约100 mg，提取总RNA，紫外分光光度法检测定量总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。按试剂盒操作说明反转录合成cDNA，产物进行PCR反应。反应条件为：HIF-1α：95 ℃ 2 min(预变性)；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 10 min；引物由Invitrogen公司合成，HIF-1α引物：上游：5′-ATACTGATTGCATCTCCATCTTCTACC-3′，下游：5′-TCAGTTAACTTGATCCAAAGCTCTGAG-3′，扩增产物长度为570 bp[4]；β-actin引物：上游：5′-TCCTAGCACCATGAAGATC-3′，下游：5′-AAACGCAG-CTCAGTAACAG-3′，扩增产物长度为180 bp[5]。取PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像分析系统进行处理分析，计算各组HIF-1α扩增带吸光度(Af)与β-actin扩增带吸光度(Ab)的比值作为HIF-1α mRNA的相对表达量。

1.3.5海马区HIF-1α蛋白定位采用免疫荧光组织化学染色法。将海马区脑组织石蜡切片以二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，0.01 mol/L PBS漂洗。37 ℃用0.4%胃蛋白酶消化30 min，0.01 mol/L PBS漂洗，冷风吹干置于湿盒，滴加10%兔血清封闭液室温孵育30 min。滴加50 μL的1∶100稀释的兔抗大鼠HIF-1α IgG单克隆抗体，4 ℃孵育过夜。室温放置30 min后用0.01 mol/L PBS漂洗。避光条件下滴加50 μL稀释度为1∶100的FITC标记的羊抗兔抗体，于37 ℃孵育45 min，0.01 mol/L PBS漂洗，用抗荧光衰减封片剂进行封片。激光共聚焦显微镜观察、摄像，FITC的激发波长和发射波长分别为488 nm和520 nm。用PBS代替一抗在相同条件下进行空白对照实验。FITC标记的HIF-1α蛋白阳性细胞出现绿色荧光。

2结果

2.1各组脑组织海马区病理学改变光学显微镜下可见，常氧对照组海马各区神经细胞饱满，呈条索状规则排列，胞质均匀，呈淡红色，胞核呈淡蓝色圆形或椭圆形，核仁清晰。低压缺氧6 h组海马CA1区可见部分神经细胞凋亡，皱缩成多边形，胞质红色深染，核仁消失；CA2、CA3及CA4区神经细胞损伤主要以水肿为主，部分细胞胞体肿胀，胞核肿大或消失，胞质淡染。低压缺氧12 h、18 h及24 h组海马各区神经细胞主要以凋亡或坏死为主，可见神经细胞数量明显减少，呈不规则稀疏排列，大部分细胞胞核破碎，细胞间质中存在大量细胞碎片及凋亡小体，胞质深染；随着缺氧时间的延长损伤逐渐加重，且海马各区的损伤程度以CA1区最为严重，CA2、CA3及CA4区损伤逐渐减轻。见插页Ⅰ图2。

2.2各组脑含水量比较常氧对照组及低压缺氧6、12、18、24 h组脑含水量分别为0.66±0.01、0.69±0.01、0.73±0.01、0.80±0.01、0.82±0.01，低压缺氧18 h组>低压缺氧12 h组>低压缺氧6 h组>常氧对照组(P均<0.01)，低压缺氧24 h组与低压缺氧18 h组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3各组脑组织NOS活性及NO含量比较与常氧对照组比较，各低压缺氧组脑组织NOS活性均显著升高(P<0.01)，在缺氧12 h后达到最大值，低压缺氧18 h、24 h组与12 h组相比呈下降趋势；与常氧对照组比较，除低压缺氧6 h组外，其余各低压缺氧组脑组织NO含量均显著增加(P均<0.01)，随着缺氧时间的延长，NO含量逐渐增加；见表1。

表1　各组脑组织NOS活性与NO含量比较±s)

注：与常氧对照组比较，*P<0.01；与低压缺氧6 h组比较，△P<0.05，□P<0.01；与低压缺氧12 h、18 h组比较，※P<0.01。

2.4各组脑组织海马区HIF-1α mRNA表达比较常氧对照组海马区未检测到HIF-1α mRNA，低压缺氧6、12、18、24 h组HIF-1α mRNA相对表达量分别为0.85±0.06、1.39±0.09、1.86±0.13、1.98±0.20，两两比较差异均有统计学意义(P<0.01或<0.05)；见图1。

注：M为Marker；1为常氧对照组；2~5分别为低压缺氧6、12、18、24 h组。

图1各组脑组织海马区HIF-1α mRNA表达

2.5各组脑组织海马区HIF-1α蛋白定位比较常氧对照组海马各区均未出现HIF-1α阳性信号；低压缺氧6 h组HIF-1α在海马各区部分神经细胞胞质中大量表达；随着缺氧损伤时间的延长，在低压缺氧12 h组海马区大部分神经细胞胞核及胞质中均可观察到HIF-1α阳性信号；虽然在低压缺氧18 h和24 h组中大量神经细胞凋亡、坏死，胞核破碎，但在胞核区仍可见HIF-1α阳性信号；见插页Ⅰ图3。

3讨论

脑是人类各种生命活动的“指挥官”，对氧及能量的需求量很大，且自身并无储备功能，因此各种因素导致的脑缺氧都会使脑组织很快出现代谢功能障碍，引起神经细胞凋亡、坏死，最终导致不可逆性脑损伤。研究表明，缺氧会影响大鼠脑学习和记忆功能[5~8]。Mishra等[9]等研究发现，与其他原因导致的脑损伤不同，负责学习和记忆等功能的海马体对缺氧性损伤比脑皮质更为敏感。本实验也发现，海马各区神经细胞损伤程度随着缺氧时间的延长而加重，均出现不同程度的凋亡或坏死，细胞数量明显减少；且海马各区损伤程度不同，以CA1区损伤最严重，CA2、CA3及CA4区损伤程度逐渐减轻，提示CA1区是海马体对缺氧最为敏感的部位，与Kihara等[10]观察到的结果相符。

急性缺氧容易引起脑水肿，脑水肿是引起颅内高压的重要原因，参与了缺氧性脑损伤的许多病理生理过程。张艳超等[11]采用Morris水迷宫试验观察了低压缺氧脑损伤模型大鼠的学习记忆功能，结果发现急性低压缺氧可导致大鼠脑水肿，从而影响大鼠学习和记忆能力。本研究结果证实低压缺氧后大鼠脑含水量随缺氧时间的延长逐渐增加，说明脑水肿随着低压缺氧的持续逐渐加重。值得注意的是，病理染色结果显示急性低压缺氧后脑海马区神经细胞首先表现为水肿，随低压缺氧时间的延长，神经细胞出现凋亡和坏死，而脑含水量测定结果显示脑水肿程度逐渐加重，提示急性低压缺氧后脑水肿可能主要发生在大脑皮质等部位，而非海马区。

在脑缺氧损伤过程中，HIF-1α起到至关重要的作用。在常氧状态下，受脯氨酰羟化酶(PHD)的调控HIF-1α不表达或低表达，缺氧时PHD的调控受阻，HIF-1α得以聚集入核与HIF-1β结合激活下游基因，通过调控包括EPO及NOS等多种靶基因来调节缺氧反应[12]。NO在脑缺血损伤中的作用一直倍受争议。研究表明，脑内NO既有神经保护作用，又有神经毒性作用，而其发挥何种作用与其浓度及由何种类型NOS催化生成密切相关[13,14]。NOS分为三种类型：内皮型(eNOS)、神经型(nNOS)以及诱导型(iNOS)，eNOS活性增加可能具有神经细胞保护作用，而nNOS及iNOS活性增加则可能具有神经毒性作用。大量研究表明，HIF-1α可通过调节NOS的活性从而影响NO生成量，对缺氧损伤起到保护作用[15]。本研究结果表明，常氧对照组HIF-1α mRNA无表达，低压缺氧6 h后开始出现表达，且随缺氧时间的延长表达逐渐升高；免疫荧光组织化学染色结果显示常氧对照组中海马各区均未出现HIF-1α阳性信号，缺氧后各组大鼠脑海马区均可见HIF-1α阳性信号，首先在胞质出现阳性表达，缺氧12 h，与常氧对照组相比显著增加，且随缺氧时间的延长呈递增趋势；与常氧对照组相比，各低压缺氧组脑组织中NOS活性均显著升高，在缺氧12 h后达到最大值，缺氧18、24 h呈下降趋势。根据以上结果结合文献报道，推测缺氧早期大脑应激使得脑组织NOS活性升高，NO含量增加，后者激活HIF-1α；缺氧12 h后，HIF-1α转移入核，调控NOS活性，影响NO生成，发挥脑保护作用。总之，HIF-1α的应激性表达可能是对急性低压缺氧性脑损伤的保护调控。

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Temporal changes of HIF-1α and rat brain hippocampus injury induced by acute hypobaric hypoxia

ZHANGWenbin1,SUChang,ZHANGYongliang,LIJianyu,LILingzhi

(1TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the temporal changes of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) in rat brain hippocampus after acute hypobaric hypoxia and to explore the relationship between the changes and brain injury. MethodsWe randomly divided 100 male SD rats into the normoxic control group and hypoxia injury groups. The rats of hypoxia injury groups were further divided into four subgroups (6 h, 12 h, 18 h and 24 h) on the basis of the duration in hypobaric hypoxia and 20 rats in each group. Except the control group, other four subgroups were placed in hypobaric chamber imitating a plateau of 7000 meters. After hypobaric hypoxia injury, the morphological changes of hippocampus were observed by HE staining. The brain water content, the level of NO and the activity of nitric oxide synthase (NOS) were detected. The expression of HIF-1α mRNA was detected by RT-PCR and HIF-1α mRNA protein was detected by immunofluorescence staining. Results①Compared with the control group, after hypobaric hypoxia, the neurocytes in the hippocampus showed varying degrees of swelling, necrosis, apoptosis and karyorrhexis or karyolysis. The cytoplasm was stained with inhomogeneous oxyphilic red colour. The CA1 in hippocampus was more sensitive to hypobaric hypoxia than the others. ②Compared with control group, the brain water content was significantly increased in a time-dependent manner in the subgroups (all P<0.01). ③Compared with the control group, the activities of NOS in each subgroup was increased (all P<0.01). Meanwhile, except the 6 h group, the levels of NO in each subgroup was increased in a time-dependent manner (all P<0.01). ④The expression of HIF-1α mRNA was not detected in the control group. Compared with the control group, the expression of HIF-1α was significantly increased with a time-dependent manner in the subgroups (P<0.01 or P<0.05). The results of immunofluorescence showed no green fluorescence of HIF-1α protein was found in hippocampus of the control group. After hypobaric hypoxia, a weak green fluorescence appeared in part of cytoplasm at first, but with prolonged hypoxia time, a gradually enhanced fluorescence was observed and it showed a trend of aggregating to the nucleus. ConclusionsAcute hypobaric hypoxia increased the brain water content and led to cerebral edema and the extent of damage was aggravated with prolonged hypoxia time. Stressful expression of HIF-1α played an important role in protective regulation of cerebral injury induced by acute hypobaric hypoxia.

Key words:brain injures; hypobaric hypoxia; nitric oxide; nitric oxide synthase; brain edema; hypoxia-inducible factor-1α; rat

(收稿日期：2015-08-15)

中图分类号：R742

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)04-0008-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.04.003

通信作者简介：李灵芝(1963-)，女，博士生导师，教授，主任，主要研究方向为缺氧损伤及其防治。E-mail： 13682196000@163.com

作者简介：第一张文彬(1990-)，男，硕士研究生，主要研究方向为抗缺氧药物研究。E-mail： llzhx@aliyun.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81471823)；天津市重点基金资助项目(12JCZDJC34700)。