氯化锂在细菌性化脓性角膜炎中的调控*



·论著·

氯化锂在细菌性化脓性角膜炎中的调控*

陈康1，2，傅强1，易冰1，罗燕香1，孙世珺1，张秀明1△

(1.中山大学附属中山医院检验医学中心，广东中山 528403；2.南方医科大学，广东广州 510515)

摘要:目的探讨氯化锂(LiCl)在细菌性化脓性角膜炎中发挥的作用及其调控机制。方法Western-blot检测LiCl应用的效果后，结膜下注射LiCl观察疾病进展；实时荧光定量PCR检测炎性因子的表达；TUNEL和流式细胞术检测细胞凋亡。结果LiCl延缓角膜炎的疾病进展；随后实验发现LiCl促进抑炎因子分泌抑制促炎因子的分泌；促进角膜浸润细胞的凋亡。结论LiCl通过调节炎性因子促进细胞凋亡，抑制角膜炎症反应，在铜绿假单胞菌角膜炎中发挥角膜保护作用。

关键词:细菌性角膜炎；炎症反应；细胞凋亡

细菌性化脓性角膜炎是致角膜盲的主要原因之一[1]。造成细菌性化脓性角膜炎的病原体众多，其中铜绿假单胞菌引起的化脓性角膜炎占首位[2]。铜绿假单胞菌(PA)是革兰阴性条件致病菌，当角膜发生损伤时易于被感染诱发角膜炎，其致病机制主要是大量炎症细胞和细胞因子的聚集引起过度炎症反应导致的角膜免疫病理损伤[3]。因此，如何抑制过度炎症引起的免疫病理损伤是治疗疾病的关键。作为一个化学分子，氯化锂(LiCl)可参与多个生理调节过程，如糖原的合成、基因的表达、炎症调节及细胞凋亡[4]。研究报道LiCl可在内毒素诱发的炎症[5]、Toll样受体介导的慢性小肠炎[6]、弗朗西斯氏菌感染[7]中抑制炎症反应。此外，LiCl可调节多种细胞的凋亡，如巨噬细胞、神经细胞、淋巴细胞、上皮细胞等[8-11]。然而，LiCl在铜绿假单胞菌感染引起的化脓性角膜炎中的作用还未知。研究报道，LiCl作为药物可治疗精神双向障碍[12]，并在阿尔茨海默氏病[13]、糖尿病[14]中有潜在的治疗效果。然而，LiCl可否应用于化脓性角膜炎中还有待证明。本研究发现，LiCl通过调节细胞因子分泌和浸润细胞的凋亡，抑制角膜局部炎症反应，延缓角膜炎疾病进展，在化脓性角膜炎中发挥角膜保护作用。

1材料与方法

1.1角膜炎动物模型的建立及临床炎症分级用乙醚麻醉小鼠后，在体视显微镜40倍放大倍数下用25 G的针头在小鼠的左侧眼角膜上连续划3下，每次划痕约1 mm。用移液器滴加入5 L的1×106CFU/mL菌量于划伤角膜，右侧眼未经任何处理作为正常对照。感染PA的小鼠角膜于1、3和5 d观察角膜病变情况。根据已建立的角膜疾病临床分级评分如下：0级，角膜清澈或轻度浑浊，浑浊范围部分或完全遮盖瞳孔；+1级，角膜轻度浑浊，浑浊范围部分或完全遮盖眼前段；+2级，角膜浑浊度增高，浑浊范围部分或完全遮盖眼前段；+3级，角膜高度浑浊，浑浊范围完全遮盖眼前段；+4级，角膜穿孔。感染后5 d，裂隙灯显微镜观察并拍摄细菌感染后小鼠角膜的炎症状态，用临床评分法确定角膜疾病的严重程度。

1.2方法

1.2.1Western-blot结膜下注射LiCl及对照NaCl，收集角膜的蛋白样品，经SDS-PAGE后转膜至硝酸纤维膜上，分别孵育5%脱脂奶粉、磷酸化糖原合酶激酶(P-GSK3)(1∶1 000)的一抗过夜、抗兔二抗1 h。经曝光检测目的蛋白的量。

1.2.2Real-time PCR用TRIzol法提取细胞RNA。1 μg RNA转录成cDNA，用SYBR Green进行实时荧光定量PCR扩增。白介素10(IL-10)、白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和β-actin的引物序列见表 1。

1.2.3TUNEL取LiCl/NaCl处理后的感染及未感染眼球，4%福尔马林固定，石蜡包埋切片。切片经脱蜡脱水后用末端脱氧核苷酰酶试剂盒染断裂DNA末端以标记凋亡细胞，用核染色剂4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染细胞核，封片后荧光显微镜下观察。

表1　　引物列表

1.2.4流式细胞术取LiCl/NaCl处理后的感染角膜(每组5只)胶原酶消化，筛网滤过收集单细胞悬液。细胞悬液避光孵育含5 L碘化丙啶(PI)的结合缓冲液，流式细胞仪上分析细胞凋亡(PI阳性细胞数量)。

2结果

2.1结膜下注射LiCl的效果为了研究LiCl在PA角膜炎中的作用，结膜下注射LiCl或NaCl(对照)，Western-blot显示，PA感染小鼠角膜后，P-GSK3 的表达低于正常角膜(图1，line2比line1)，结膜下注射LiCl，P-GSK3 的表达水平明显上调(图1，line3比line2)。见图1(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。

2.2LiCl延缓角膜炎疾病进展临床评分结果显示，在PA感染后1、3、5 d，LiCl注射组疾病的严重程度减轻，1、3、5 d的临床评分分别为+1、+2、+2/+3，而对照组的临床评分分别为+2、+3、+4(图 2A)。裂隙灯照片显示，LiCl处理组(图2C)角膜中/重度浑浊遮盖瞳孔区；对照组(图 2B)膜溃疡穿孔。HE染色结果显示，相对于LiCl处理组(2E)对照组(图 2D)角膜重度水肿，角膜增厚，并有大量的炎性细胞的浸润。临床表现结果提示LiCl能够延缓PA角膜炎的疾病进程，在PA角膜炎中发挥角膜保护作用。见图2(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。

2.3LiCl调节炎性因子的分泌炎性细胞浸润和炎性因子的分泌是引起角膜过度炎症的关键因素。为了全面了解角膜的炎症反应情况，检测LiCl和NaCl处理组炎性因子的表达，结果显示，在PA感染后1、5 d，LiCl促进抑炎因子IL-10的表达(图3A)，并且抑制促炎因子TNF-α的表达(图3D)，而对促炎性因子IL-6(图 3B)和IL-1β(图3C)无影响。在未感染时，两组的炎性因子的分泌无差别(图3，A-D)。见图3(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。

2.4LiCl促进角膜浸润细胞的凋亡炎性细胞的凋亡是控制宿主过度炎症的一个重要措施。TUNEL检测发现，PA感染后5 d，与对照组相比(图 4B)，LiCl处理组(图 4D)的角膜基质中有更多TUNEL染色为阳性的细胞(绿色荧光)，且与核染色剂(紫色荧光)共定位，为凋亡细胞(图 4B和D中的白色箭头所指细胞)。PA未感染时，LiCl(图 4C)和NaCl(图 4A)处理组中均未见TUNEL染色为阳性的细胞，见图4(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。为了进一步量化LiCl处理后角膜浸润细胞凋亡的情况，流式检测结果显示，PA感染1、5 d后，LiCl促进细胞的凋亡，其PI阳性的凋亡细胞的比例分别为11.3%和20.3%，而对照组凋亡细胞的比例为5.97%和10.6%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图5(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。

3讨论

LiCl在阿尔茨海默氏病[13]、糖尿病[14]及精神双向障碍[12]中有潜在的治疗作用，然而，LiCl在铜绿假单胞菌角膜炎中的作用还未知。本研究发现，LiCl通过调节炎性因子分泌和细胞凋亡，抑制炎症反应，发挥角膜保护作用。

据报道，LiCl在多种疾病中可抑制炎症反应。Nahman等[5]报道，LiCl通过抑制TNF-α、IL-1β、活性氮自由基在精神双向障碍中发挥抑炎作用；Beurel等[15]报道LiCl在内毒素休克的动物模型中抑制内毒素诱导的IL-6的产生；Wang等[11]报道LiCl通过降低促炎性因子TNF-α和RANTES的表达在内毒素血症诱发的急性肾衰竭中发挥保护作用。本研究发现LiCl通过促进IL-10的表达，抑制TNF-α的表达在化脓性角膜炎中发挥抑炎作用。同时，组织化学染色结果显示，LiCl处理组角膜浸润细胞明显减少。炎性因子分泌的调节和炎性细胞浸润的减少是抑制角膜过度炎症，延缓疾病进展。

炎性细胞的凋亡也是机体降低炎症反应的一个策略。研究发现，在巨噬细胞[8]、神经细胞[9]等中，LiCl促进细胞凋亡；而抑制急性T淋巴细胞白血病细胞[10]、肾小管上皮细胞[11]的凋亡。这提示，LiCl调节凋亡的作用依赖不同的细胞类型和刺激因素。TUNEL和流式细胞术结果均显示，在铜绿假单胞菌感染时，LiCl促进角膜浸润炎性细胞的凋亡。

综上所述，本研究揭示了LiCl在细菌性化脓性角膜炎中的调节作用，为LiCl的临床辅助应用提供坚实的理论基础。

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The regulatory role of LiCl in microbial suppurative keratitis*

ChenKang1,2,FuQiang1,YiBing1,LuoYanxiang1,SunShijun1,ZhangXiuming1△

(1.DivisionofClinicalLaboratory,ZhongshanHospitalofSunYat-senUniversity,Zhongshan,Guangdong528403,China；2.SouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510515,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the role of LiCl in microbial suppurative keratitis.MethodsWestern-blot assay was used to detect the efficacy of LiCl.Inflammatory cytokine levels were examined using Real-time PCR.Cell apoptosis was detected by using TUNEL and flow cytometry assays.ResultsLiCl promoted corneal resistance to PA infection.Real-time PCR data showed that LiCl enhanced IL-10 expression,but suppressed TNF-expression.TUNEL and flow cytometry data showed that LiCl promoted the apoptosis of infiltrating cells.ConclusionLiCl promoted host resistance against microbial suppurative keratitis,via regulating inflammatory cytokine expression and cell apoptosis.

Key words:bacterial keratitis；inflammation；cell apoptosis

(收稿日期：2015-11-10)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.04.019

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)04-0478-03

基金项目：国家自然科学基金青年基金项目(81401645)；广东省医学科研基金(B2014447)；中山市科技计划项目(2014A17C098)。

作者简介：陈康，女，主管技师，主要从事分子诊断与检验研究。△通讯作者，E-mail：zxm0760@163.com。