大瓣铁线莲的粗提物体外抗癌活性研究△

苏　琨　代金华　白小荣（.内蒙古科技大学包头医学院　包头04040；.内蒙古集宁师范学院数学系　集宁　0000）



大瓣铁线莲的粗提物体外抗癌活性研究△

苏琨1代金华2白小荣1（1.内蒙古科技大学包头医学院包头014040；2.内蒙古集宁师范学院数学系集宁012000）

摘要：目的：研究大瓣铁线莲的四种粗提物体外抗癌活性。方法：针对人肝癌细胞HepG2，采用MTT比色法，检测4种不同溶剂的粗提物做体外抗癌活性研究，计算肿瘤细胞增殖抑制率和IC50。结果：除乙酸乙酯粗提物外，石油醚、水、正丁醇粗提物的吸光度A与阴性对照组比较有显著差异，剂量和药效存在一定相关性。结论；蒙药大瓣铁线莲石油醚、水、正丁醇粗提物对人肝癌细胞HepG2有一定抑制作用，有必要对其活性成分进行筛选和分离。

关键词：大瓣铁线莲粗提物MTT比色法体外抗癌活性

大瓣铁线莲，毛茛科铁线莲属，学名Clematismacropetala Ledeb．主要分布于东北、西北、河北、山西等地区，生于山地林下、林缘草甸[1]。大瓣铁线莲的药材基原为大瓣铁线莲的地上部分，收载于《中华本草》（蒙药卷）、《中华医学百科全书》（蒙医分卷）、《无误蒙药鉴》和《内蒙古植物药志》等著作，主治肝热、肺热、肠刺痛、热泻，有理胃火、助消化、祛解痞的功效。经查阅文献发现，大瓣铁线莲的药理研究鲜有报道。利用MTT比色法对大瓣铁线莲的四种粗提物体外抗癌活性筛选，为大瓣铁线莲的合理应用和开发提供科学依据，丰富民族医药现代化研究的科学内涵。

1　仪器与材料

CO2细胞培养箱，日本SANYO SHEL LAB；酶标仪，Thermo Scientific Multiskan FC酶标仪。

人肝癌细胞株HepG2引自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库；DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、胎牛血清购自美国Gibco公司；四季青胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司。PBS，DMSO和青链霉素均购自海克隆生物化学制品（北京）有限公司。噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO），购自美国Sigma公司；去离子水，正丁醇、乙酸乙酯、石油醚均为分析纯。

大瓣铁线莲药材为2014年7月采于包头市九峰山，经包头医学院教授李旻辉鉴定为毛茛科铁线莲属大瓣铁线莲（Clematis macropetala Ledeb.）

2　方法

2.1粗提物的提取：大瓣铁线莲地上部分自然阴干后，取其15倍质量的工业酒精回流提取4次，每次3h。合并提取液并回收溶剂至膏状。浸膏依次用8倍质量的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取3次，合并相同提取液并回收溶剂，得4种溶剂的粗提物P（石油醚粗提物）、E（乙酸乙酯粗提物）、B（正丁醇粗提物）、W（水粗提物），置于低温冰箱保存。使用前用杜尔伯科改良伊格尔高糖培养基（即DMEM高糖培养基）稀释到所需浓度。

2.2细胞培养：在5%CO2、37℃条件下，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养人肝癌细胞HepG2，2d传代或换液1次，取对数生长期细胞进行后续实验。

2.3体外抗肝癌活性成分筛选：取对数生长期的HepG2细胞，调节细胞密度为5×104mL-1，接种于96孔培养板，每孔100μL。培养过夜后，阴性对照组加入100μL培养基，给药组分别加入终浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5、1mg·mL-1铁线莲粗提物；阳性对照组加入不同浓度的顺铂（0.001、0.005、0.01、0.02、0.03mg·mL-1），另设调零组（不加细胞及药物），每组设5个复孔，培养24h后，弃去含药培养基，每孔加入100μL无血清培养基及20μLMTT （5mg·mL-1）。在5%CO2、37℃条件下培养4h后，吸去培养基和MTT，每孔加入150μLDMSO，在低速摇床上震荡10min，在酶标仪上492nm波长处测定各组吸光度（A值）。

3　结果

3.14种粗提物的吸光度A值测定：在5种不同浓度下测定吸光度A，结果见表1。表中的数据均为减去空白的吸光度A，每组数据测定5次，用平均值±SD表示。

表1　不同溶剂、不同浓度粗提物的吸光度A

3.2不同浓度粗提物的HepG2肿瘤细胞增殖抑制率计算：根据公式计算细胞增殖率:细胞增殖抑制率（%）=（1-加药孔平均A 值/阴性对照孔平均A值）×100%。A值为每组各复孔的均值，结果见表2。

表2　不同浓度粗提物的HepG2肿瘤细胞增殖抑制率

3.3剂量和药效关系：以抑制率为Y轴，浓度为X轴，作剂量和药效曲线图，见图1。

3.4不同溶剂的粗提物的IC50：采用SPSS19.0统计学软件，采用logit模式进行probit分析并计算IC50。

表3　四种粗提物的IC50

4　结论与讨论

关于半数抑制浓度IC50的计算方法有很多，如线性回归法[2]，或者利用SAS、Origin等专业软件绘制曲线方程后，再计算出IC50[3～6]。由实验数据可知，抑制率和药物浓度不是严格的线性关系，用线性回归计算得到的IC50存在较大误差。本实验利用SPSS软件，录入浓度、抑制率、总值（数值=1）三组相关数据，采用logit模式进行probit分析，由软件计算得到IC50值（概率为0.50对应的浓度值）。该方法对实验数据的契合度高，分析结果更准确。

除乙酸乙酯粗提物外，石油醚粗提物P、正丁醇粗提物B和水粗提物W的IC50依次为0.797、0.543、1.031mg·mL-1。虽然三者的IC50均大于阳性组（阳性组顺铂的IC50为0.04mg·mL-1），但剂量和药效关系都具有明显正相关性，说明三种提取物存在一定的抗癌活性。在今后对大瓣铁线莲抗癌作用深入研究时，可以优先选择正丁醇作为溶剂，提取、分离出抗癌活性更高的单体化合物。

参考文献

[1]中华本草（蒙药卷）[M].上海：上海科学技术出版社，2004：80.

[2]张少梅.广西产川黄柏和巴豆中抗癌活性成分的初步研究[D].广西师范大学，2008：24-26.

[3]尹美珍，王静晖，陈敬钦，等.艾叶粗提物的分离提取及其抗肝癌活性组分筛选[J].黄石理工学院学报，2010，5：56-58.

[4]王冰芳.西兰苔叶黄酮的提取、分离、鉴定及体外抗癌活性研究[D].华南理工大学，2010：45-49.

[5]刘江涛，陈信义，王玉芝.穿山龙粗提物抗肿瘤体外实验研究[J].中国中医药信息杂志，2004，11（3）：206-207.

[6]曲中原.青龙衣抗肿瘤活性成分及其作用机制研究[D].北京中医药大学，2010.

[7]宋旭红.新疆阿魏蘑菇提取物抗肿瘤作用的分子生物学研究[D].新疆医科大学，2002：40-44.

[8]王奇志，王海婷，管福琴，等.海滨木槿粗提物体外抗肿瘤作用的研究[C].海峡两岸暨CSNR全国第十届中药及天然药物资源学术研讨会论文集，2012：624-626.

[9]杨荣，刘群，康莲莲，等.藏药绿萝花体外抑制肿瘤细胞生长的实验研究[J].中成药，2015，9：2061-2065.

[10]韩天娇，陈燕忠，王定勇，等.独子藤各部位提取物体外抗癌活性研究[J].食品与药品，2015，2：99-101.

基金项目：△内蒙古自治区高等学校科学研究项目（NJZY13250）。

中图分类号：R927.1

文献标识码：B

文章编号：1672-8351（2016）01-0099-02