抗人胸腺免疫球蛋白联合干扰素γ和白介素2诱导培养细胞因子诱导的杀伤细胞的效果*

黄建敏, 阚全程, 张　震, 杨双宁，赵　璇，李　红，王丽萍，张　毅#

1)郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心 郑州 450052　2)郑州大学第一附属医院药学部 郑州 450052　3)郑州大学生物工程系 郑州 450001　4)郑州大学第一附属医院肿瘤科 郑州 450052



抗人胸腺免疫球蛋白联合干扰素γ和白介素2诱导培养细胞因子诱导的杀伤细胞的效果*

黄建敏1), 阚全程2), 张震1,3), 杨双宁1)，赵璇1)，李红1)，王丽萍4)，张毅1,3)#

1)郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心 郑州 4500522)郑州大学第一附属医院药学部 郑州 4500523)郑州大学生物工程系 郑州 4500014)郑州大学第一附属医院肿瘤科 郑州 450052

关键词细胞因子诱导的杀伤细胞；抗人胸腺免疫球蛋白；干扰素γ；白介素2

摘要目的：探讨抗人胸腺免疫球蛋白(ATG)诱导培养的细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的活性和功能,为CIK培养体系优化提供依据。方法：采集9例肿瘤患者外周血10 mL，分离单个核细胞，用CD3单抗或ATG(50、250、500 μg/L)联合干扰素γ、白介素2诱导培养。培养至第6～10天，采用流式细胞术检测细胞增殖状况，培养至第13天，采用流式细胞术检测CIK免疫表型(CD3、CD4、CD8、CD56)、激活性表面标志(CD28、CD27、CD69、NKG2D)、抑制性表面标志(PD1、CD152)及Granzyme-B、干扰素γ分泌量。结果：4种培养方式下，细胞增殖状况无统计学意义(P>0.05)。与CD3单抗相比，ATG培养的CIK中CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞比例较低(P<0.001)，CD3-CD56+与CD8+CD69+细胞比例较高，CD56+细胞干扰素γ和Granzyme-B分泌水平较高。结论：ATG诱导的CIK免疫活性优于用CD3单抗经典方案培养的CIK，抗肿瘤能力较强。

Function and activity of cytokine induced killer cells induced by anti-human thymocyte immunoglobulin combined with interferon γ and IL-2

HUANGJianmin1),KANQuancheng2),ZHANGZhen1,3),YANGShuangning1),ZHAOXuan1),LIHong1),WANGLiping4),ZHANGYi1,3)

1)BiotherapyCenter,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)DepartmentofPharmacology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500523)SchoolofBioengineering,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500524)DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordscytokine induced killer cell;anti-human thymocyte immunoglobulin;interferon γ;interleukin-2

AbstractAim: To investigate the activity and function of the cytokine induced killer cells(CIK) cultured by anti-human thymocyte immunoglobulin(ATG) combined with recombinant human interferon γ(IFN-γ) and recombinant human interleukin-2(IL-2).Methods: The peripheral blood(10 mL) was collected from 9 cancer patients. The peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) were isolated by Ficoll density gradient centrifugation, and then were cultured with anti CD3 monoclonal antibody or different concentration(50,250,500 μg/L) of ATG combined with IFN-γ and IL-2. Cell proliferation was assessed using flow cytometry from D6 to D10. At the 13th day,the phenotype(CD3,CD4,CD8,CD56), the expressions of activated markers(CD28,CD27,CD69 and NKG2D) and inhibitory markers(PD1 and CD152), as well as the levels of IFN-γ and Granzyme-B secretion were analyzed by flow cytometry. Results: Compared with anti-CD3 group, the proportions of CD3+CD4+cells and CD3+CD8+cells were lower in ATG groups(P<0.001), while the percentages of CD3-CD56+natural killer cells and CD8+CD69+cells were elevated significantly in ATG groups(P<0.05). Furthermore, the levels of IFN-γ and Granzyme B secretion of CD56+cells in all ATG groups were higher than that of anti-CD3 group(P<0.05). Conclusion: The CIK induced by ATG instead of CD3 monoclonal antibody combined with IFN-γ and IL-2 exhibit better immune-competence and enhanced cytotoxic activity.

细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells,CIK)免疫治疗目前是临床广泛应用的肿瘤过继免疫治疗方法之一。CIK培养的经典方法是将少量患者外周血单个核细胞用抗CD3单克隆抗体联合重组人干扰素γ(recombinant human interferon γ， IFN-γ)、重组人白介素2(recombinant human interleukin-2，IL-2)培养14 d。这种方法培养的CIK具有增殖快、抗肿瘤谱广的特点，但其活性和功能还需要进一步增强和提高。目前,对CIK细胞培养体系进行优化，增强其活性和功能的报道较少。作者采用抗人胸腺细胞免疫球蛋白(anti-human-thymocyte immunoglobulin，ATG)代替抗CD3单克隆抗体诱导培养CIK，观察其对CIK细胞表型、增殖和功能的影响。

1材料与方法

1.1标本来源9例恶性肿瘤患者均来自郑州大学第一附属医院肿瘤科。其中肺癌2例，结肠癌1例，胃癌1例，食管癌1例，胰腺癌1例，前列腺癌1例，肾癌1例，膀胱癌1例。标本在征得患者同意并签订知情同意书后采集。

1.2药品、试剂和仪器流式细胞仪FASCanto Ⅱ购自美国 BD公司，各种免疫荧光抗体购自美国BD Pharmingen公司，ATG购自法国IMTIX-SANGSTAT 制药公司，抗CD3单克隆抗体购自以色列Prospecbio公司，Hyclone RPMI 1640培养基购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司，胎牛血清购自Gibco 公司，IL-2购自北京双鹭药业股份有限公司， IFN-γ购自上海凯茂药业有限公司，Ficoll-Plaque淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物高科技术有限公司，Annexin V/PI试剂盒购自北京碧云天公司，佛波酯(phorbol-12-mirystate-13-acetate,PMA)和离子霉素购自Sigma 公司，阻断剂brefeldin A solution(BFA)购自 Biolegend 公司。

1.3实验分组无菌条件下采集肿瘤患者的外周血10 mL(肝素抗凝)，采用Ficoll-Plaque淋巴细胞分离液进行密度梯度离心(2 500 r/min，25 min)，提取白膜层，PBS洗涤后重悬于RPMI 1640培养基中，调整细胞密度为2×106mL-1，分4组培养。4组细胞加入IFN-γ(1 000 U/mL)，置于37 ℃、体积分数为5%CO2的培养箱中培养24 h，然后CD3(对照)组和ATG1组、ATG2组、ATG3组分别加入抗CD3单克隆抗体(25 μg/L) 和50、250、500 μg/L的ATG，再加入IL-2(1 000 U/mL)继续培养，每隔2～3 d换液并补加完全培养基及IL-2。

1.4CIK增殖的检测培养至第6天时，取各组细胞1×106个，离心洗涤后加入无血清培养基1 mL,避光加入5 mmol/L乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)1 μL，37 ℃孵育15 min，加入体积分数10%胎牛血清终止反应，4 ℃ 放置8 min，PBS洗涤2次(将未结合的CFSE洗去)，分别加入相应培养基1 mL,重悬于24孔板中。各组取100 μL用流式细胞仪进行母本细胞CFSE荧光信号的检测，连续检测5 d。用Modifit软件分析细胞的增殖指数。

1.5CIK免疫表型及主要表面标志物的检测培养至第13天，取各组细胞，加入免疫荧光标记抗体或相应的同型抗体，混匀后室温避光孵育15 min，加入PBS离心(1 500 r/min,5 min)、洗涤，PBS重悬后上流式细胞仪检测细胞免疫表型(CD3、CD4、CD8、CD56),激活性表面标志(CD28、CD27、CD69、NKG2D)和抑制性表面标志(PD1、CD152)。

1.7统计学处理采用Prism 5.0进行统计分析，4组细胞各监测指标的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2结果

2.14组CIK的增殖情况4组细胞均于培养至第4天时开始增殖，于第6天后开始检测细胞增殖指数，结果见图1。4组细胞增殖指数差异无统计学意义(第6天：F=0.056，P=0.982；第7天：F=0.108，P=0.955；第8天：F=0.225，P=0.878；第9天：F=0.316，P=0.813；第10天：F=0.230，P=0.874)。

图1　4组CIK的增殖曲线

2.24组CIK免疫表型的比较见表1、2。培养至第13天，ATG各组CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞比例较低， CD3-CD56+NK细胞比例较高；而4组CD3+CD56+T细胞比例差异无统计学意义。

表1　4组CIK的免疫表型(1)　%

*:与CD3组比较，P<0.05;ATG各组间比较,P>0.05。

表2　4组CIK的免疫表型(2)　%

*:与CD3组比较，P<0.05;ATG各组间比较,P>0.05。

2.34组CIK表面标志物表达的比较与CD3组比较， ATG各组CD8+CD69+细胞比例较高,CD8+NKG2D+细胞比例有升高的趋势,见表3。4组其他表面标志物的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。

表3　4组CIK表面标志物的表达　%

*：与CD3组比较，P<0.05；ATG各组间比较，P>0.05。

2.44组CIK IFN-γ和Granzyme-B 分泌量的比较见表4。培养至第14天，与CD3组相比， ATG各组CD56+细胞Granzyme-B和IFN-γ分泌量更高。

表4　4组CD56+CIK

*：与CD3组比较，P<0.05；ATG各组间比较，P>0.05。

3讨论

目前，肿瘤免疫治疗已成为继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗方法，其中，CIK免疫治疗因其效应细胞体外扩增速度快、杀瘤谱广而成为肿瘤细胞免疫治疗中应用最广泛的方法之一，在多种常见肿瘤如恶性黑色素瘤、肾癌、乳腺癌和鼻咽癌的治疗中取到了良好的疗效[1-5]。目前认为，CIK是一群异质性细胞，发挥抗肿瘤效应的细胞有CD3+CD56+、CD3-CD56+、CD3+CD8+细胞，其中CD3+CD56+细胞抗肿瘤活性最强[6]。

此次研究发现，不同剂量ATG培养的CIK中，CD3+CD4+细胞比例低于抗CD3单克隆抗体诱导组，而CD3-CD56+NK细胞比例升高，这一结果与Bonanno等[7]报道相符。Bonanno等[7]的研究还显示ATG诱导的CIK中调节性T细胞(Treg)的含量较抗CD3抗体诱导组低。Treg细胞主要是一群CD4+CD25+FOXP3+且具有免疫抑制功能的细胞，CD4+细胞的总体含量降低也代表这群免疫抑制细胞的数量减少，这将有利于CIK在体内发挥抗肿瘤免疫作用[8]。CD69是一个细胞活化的标志，CD8+CD69+是一群可以发挥免疫杀伤作用的活化细胞[9]。该研究中，ATG组此类细胞比例高于CD3组，也从另一个方面预示ATG诱导的CIK具有更强的杀伤活性。

作者还发现，ATG各组中CD56+细胞IFN-γ和Granzyme-B分泌量高于CD3组。分泌IFN-γ和Granzyme-B是免疫活性细胞发挥杀伤作用的重要途径之一[10]。这一结果也提示，ATG诱导培养的CIK具有更强的免疫杀伤功能。

CD3组与ATG各组细胞增殖指数没有差异，但ATG各组培养的CIK中CD3-CD56+的NK细胞比例增高。这可能是因为ATG的实验剂量耗竭了部分T细胞，使得起始T细胞数量相对降低，从而导致NK细胞成为优势增殖细胞。NK细胞治疗也是临床常用的肿瘤过继免疫治疗方法之一，是否可以利用更高剂量的ATG来耗竭培养起始细胞中的T细胞，使得NK细胞成为数量优势细胞来进行NK细胞的培养和诱导，也是一个值得探讨的课题。

综上所述，作者认为采用ATG刺激培养的CIK活性优于经典培养方案，抗肿瘤能力较强；ATG作为被批准用于临床治疗的药物，与抗CD3单克隆抗体相比较更安全可靠，且价格相对低廉，可作为其替代品用于CIK的培养。

参考文献

[1]GAMMAITONI L,GIRAUDO L,LEUCI V,et al.Effective activity of cytokine-induced killer cells against autologous metastatic melanoma including cells with stemness features[J].Clin Cancer Res,2013,19(16):4347

[2]LI JJ,GU MF,PAN K,et al.Autologous cytokine-induced killer cell transfusion in combination with gemcitabine plus cisplatin regimen chemotherapy for metastatic nasopharyngeal carcinoma[J].J Immunother,2012,35(2):189

[3]PAN K,GUAN XX,LI YQ,et al.Clinical activity of adjuvant cytokine-induced killer cell immunotherapy in patients with post-mastectomy triple-negative breast cancer[J].Clin Cancer Res,2014,20(11):3003

[4]ZHANG JY,ZHU LJ,ZHANG Q,et al.Effects of cytokine-induced killer cell treatment in colorectal cancer patients:a retrospective study[J].Biomed Pharmacother,2014,68(6):715

[5]ZHAO X,ZHANG Z,LI H,et al.Cytokine induced killer cell-based immunotherapies in patients with different stages of renal cell carcinoma[J].Cancer Lett,2015,362(2):192

[6]PAN K,WANG QJ,LIU Q,et al.The phenotype of ex vivo generated cytokine-induced killer cells is associated with overall survival in patients with cancer[J].Tumour Biol,2014,35(1):701

[7]BONANNO G,INDICONE P,MARIOTTI A,et al.Thymoglobulin, interferon-γ and interleukin-2 efficiently expand cytokine-induced killer(CIK) cells in clinical-grade cultures[J]. J Transl Med,2010,8:129

[8]LI H,YU JP,CAO S,et al.CD4+CD25+regulatory T cells decreased the antitumor activity of cytokine-induced killer(CIK) cells of lung cancer patients[J].J Clin Immunol,2007,27(3):317

[9]MORETTA A,POGGI A,PENDE D,et al.CD69-mediated pathway of lymphocyte activation: anti-CD69 monoclonal antibodies trigger the cytolytic activity of different lymphoid effector cells with the exception of cytolytic T lymphocytes expressing T cell receptor alpha/beta[J].J Exp Med,1991,174(6):1393

[10]KORNACKER M,MOLDENHAUER G,HERBST M,et al.Cytokine-induced killer cells against autologous CLL:direct cytotoxic effects and induction of immune accessory molecules by interferon-gamma[J].Int J Cancer,2006,119(6):1377

中图分类号R730.51

#通信作者：阚全程，男，1963年9月生，博士，教授，研究方向：临床药理学，E-mail:kqc2008@163.com；张毅，男，1964年4月生，博士，教授，研究方向：肿瘤免疫学、肿瘤干细胞和生物细胞治疗，E-mail:yizhang@zzu.edu.cn

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.003

*河南省卫生厅科技攻关课题201303033