Fgl2基因过表达对自身免疫性心肌炎大鼠心功能的影响*

郑振中，黄火明，梁　静

南昌大学第一附属医院心血管内科 南昌330006

△男，1975 年8月生，博士，副教授，副主任医师，研究方向：冠心病的防治和介入治疗，E-mail：greateful@163.com



Fgl2基因过表达对自身免疫性心肌炎大鼠心功能的影响*

郑振中△，黄火明，梁静

南昌大学第一附属医院心血管内科 南昌330006

△男，1975 年8月生，博士，副教授，副主任医师，研究方向：冠心病的防治和介入治疗，E-mail：greateful@163.com

关键词纤维介素蛋白2；自身免疫性心肌炎；心功能；大鼠

摘要目的：建立慢病毒介导纤维介素蛋白2(Fgl2)基因过表达自身免疫性心肌炎(EAM)大鼠模型，探讨Fgl2基因过表达对EAM大鼠心功能的影响。方法：32只雄性Lewis大鼠随机分为正常对照组、EAM组、空载体自身免疫性心肌炎组(EAM-GFP组)和Fgl2 慢病毒过表达自身免疫性心肌炎组(EAM-Fgl2组)4组。在实验第60天，对各组大鼠行心脏彩色多普勒检查，检测各组大鼠的左室短轴缩短率(LVFS)，计算左室射血分数(LVEF)，Western blot法检测各组大鼠心肌组织中Fgl2蛋白表达情况，ELISA法检测各组大鼠静脉血脑钠肽(BNP)水平。结果：4组心肌组织中Fgl2蛋白和静脉血BNP表达的水平差异有统计学意义(P均<0.001)，EAM-Fgl2组Fgl2蛋白表达高于对照组、EAM组和EAM-GFP组；与其他3组比较，EAM-Fgl2组的LVFS和LVEF均降低，差异有统计学意义(P均<0.001)。 结论：慢病毒介导的Fgl2基因过表达载体能明显上调EAM-Fgl2组心肌细胞中Fgl2蛋白的表达；且慢病毒介导的Fgl2基因过表达后可恶化EAM大鼠心功能。

Effects of Fgl2 gene over expression on heart function in autoimmune myocarditis rats

ZHENGZhenzhong，HUANGHuoming，LIANGJing

DepartmentofCardiology，theFirstAffiliatedHospital，NanchangUniversity，Nanchang330006

Key wordsfibrinogen-like protein 2;autoimmune myocarditis;heart function;rat

AbstractAim: To establish autoimmune myocarditis rat model and observe the effect of fibrinogen-like protein 2(Fgl2) gene overexpression on the heart function of autoimmune myocarditis. Methods: A total of 32 male Lewis rats were randomly allocated into EAM group, EAM-GFP group,EAM-Fgl2 group and control group.A lentiviral vector of Fgl2 gene was constructed.After myosin injection,a trans-thoracic echocardiographic analysis was performed on day 60,and LVFS and LVEF were measured. The expression of Fgl2 was measured by Western blot. BNP level was estimated with ELISA kit for BNP.Results: Compared with control group,EAM group and EAM-GFP group,the expressions of Fgl2 and BNP were significantly increased in EAM-Fgl2 group(P<0.001),while LVFS and LVEF were significantly decreased(P<0.001)．Conclusion: Fgl2 gene overexpression deteriorates the heart function of rats with EAM. Fgl2 is a potent target for the treatment of EAM.

研究[1-2]发现，纤维介素蛋白2(fibrinogen-like protein 2，Fgl2)是CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)的效应分子，其抗体能够完全阻断Treg的活力，提示Fgl2是干预心肌自身免疫损伤的有效靶点。作者以前的研究[3-5]结果证实，Fgl2 基因沉默能够促进心肌微血管内皮细胞(myocardial microvascular endothelial cells，MMVECs)的增殖和迁移，提示Fgl2 参与了血管新生的调控，其机制可能与上调血管生成素1、2的表达有关。实验性自身免疫性心肌炎(experimental autoimmunity myocarditis，EAM)动物模型是研究自身免疫介导心肌损伤的有效工具，为了明确Fgl2基因在心肌自身免疫损伤中的作用，该研究建立了EAM大鼠模型，观察Fgl2基因过表达对其心功能的影响。

1材料与方法

1.1材料与试剂HEK293T细胞购自中科院上海细胞所，重组病毒质粒及辅助包装原件载体质粒购自上海吉凯基因化学公司，LipofectamineTM2000、Trizol试剂盒购自Invitrogen公司，反转录RNA 试剂盒购自Promega 公司，RNase-free购自Axygen 公司，Fgl2 单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，化学发光底物购自美国Thermo公司，BNP-ELISA试剂盒购自上海森科公司，载有Fgl2质粒的慢病毒构建和包装及检测由吉凯基因公司完成。

1.2建立动物模型和分组采用随机数字表法将32只雄性Lewis大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)分为正常对照组、EAM组、EAM-GFP组[生理盐水稀释绿色荧光蛋白(GFP)转染的慢病毒载体5×107IU/mL，在EAM诱导的第1天，以每只大鼠1 mL的剂量进行尾静脉注射]和EAM-Fgl2组(冰浴法解冻-80 ℃存放的Fgl2过表达慢病毒载体后，生理盐水稀释至5×107IU/mL，以每只大鼠1 mL的剂量进行尾静脉注射)，对后3组大鼠其进行EAM模型诱导，将纯化猪心肌肌球蛋白溶于0.15 mol/L的PBS溶液中，控制其质量浓度为2 g/L，然后与完全弗氏佐剂等体积混合并完全乳化，使其成为均匀的乳浊液；按1 mL/只(即含肌球蛋白1 mg的剂量)在Lewis大鼠的双侧腹股沟、腋部皮下注射[6]。免疫时间为第1天和第8天，共2次。

1.3心脏彩色多普勒检测心功能在实验第60天，对各组大鼠进行心脏彩色多普勒检查。每只大鼠禁食1 d后，剔去胸部鼠毛，腹腔注射20 g/L戊巴比妥麻醉，仰卧位固定，应用超声心动图(VIVID7型号，GE公司，美国)及10.0 MHz高频线控探头(GE公司，美国)进行超声检测。取胸骨旁左室长轴切面，M型超声心动图取样线在腱索水平，测室腔的大小和室壁的厚度；取心底波群，测主动脉根部内径和左房的大小。高频线控探头置于心尖部，取心尖四腔图，取样容积置于二尖瓣瓣口，获得舒张期二尖瓣血流频谱，均按照美国超声医学标准进行上述操作。连续储存获得的上述超声图像，然后再用实时、慢速回放及冻结图像等技术对图像进行分析处理。各测量数据均取5个心动周期的均值。测量指标:测量左室射血分数[LVEF=(EDV-ESV)/EDV]、左室短轴缩短率[LVFS=(LVDd-LVDs)/LVDd]。

1.4各组大鼠静脉血脑钠肽(brain natriuretic peptide，BNP)含量的ELISA法检测在大鼠完成心功能检测后，切开胸骨，暴露心脏，用注射器迅速从右房静脉系统中抽取血5 mL血液，放入生化试管，置于2 ℃冰箱过夜后使其血清析出，将装有血液的生化管均匀排列于离心机，以3 000 r/min的速度离心15 min，用1 mL注射器吸取上清液，然后放入冻存管中-80 ℃保存。试剂盒从冷藏环境中取出后室温平衡30 min。制备标准品、加样、温育、配液、洗涤、加酶、温育、洗涤、显色：以空白孔调零，在450 nm波长处依序号测量各孔的吸光度值。加终止液，15 min内进行完上述测定。

1.5各组大鼠心肌组织中Fgl2蛋白表达的Western blot检测心功能检测完毕后处死动物，取部分心肌组织，在冰浴的裂解缓冲液中研碎成匀浆，4 ℃ 12 000g离心30 min，吸取上清。考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。每组取约40 μg蛋白质在120 g/L SDS-PAGE凝胶上电泳分离，4 ℃下电转移至PVDF膜上。室温下用含50 g/L的脱脂奶粉TBS-T溶液封闭。PVDF膜与抗体4 ℃孵育过夜，而后与辣根过氧化物酶偶联的二抗室温孵育2 h。用化学发光试剂盒按说明书要求显影、曝光，并用凝胶成像分析系统灰度扫描来定量检测蛋白质的相对表达量。各组数据均用相应GAPDH进行标准化处理。

1.6统计学处理采用SPSS 19.0进行分析，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较4组大鼠心肌组织中Fgl2蛋白和静脉血BNP水平以及左室心功能的变化，检验水准α=0.05。

2结果

2.1各组大鼠心肌组织中Fgl2蛋白表达的结果和静脉血BNP水平的比较见表1。

表1　各组大鼠心肌组织中

*：与正常对照组相比，P<0.05；#：与EAM-GFP组和EAM组相比，P<0.05。

2.2各组大鼠左室心功能的变化见表2。

表2　各组大鼠左室心功能的变化

*：与正常对照组相比，P<0.05；#：与EAM组相比，P<0.05。

3讨论

基础和临床的研究[7-8]都表明由心肌炎向心肌病发展主要是由进展性的自身免疫损伤造成的，因此，针对免疫损伤干预扩张型心肌病的发生发展是扩张型心肌病治疗研究中的热点问题之一。

Fgl2属纤维蛋白原相关蛋白超家族，其主要的生物学活性类似于活化的凝血因Ⅹa，可直接催化凝血酶原转变为凝血酶，继而使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，从而快速启动凝血，即免疫凝血[4]。Fgl2介导凝血酶原参与暴发性肝炎、自发性流产及同种和异种急性移植排斥反应[9-10]等病理过程，通过触发炎症/血栓形成，在局部高表达，启动局部凝血过程，导致纤维蛋白沉积、微血栓形成、微循环障碍和局部炎症反应，最终导致脏器形态学变化和功能障碍。

该研究结果显示：慢病毒介导的Fgl2基因过表达可明显上调其在EAM大鼠心肌细胞中的表达，增加BNP水平，恶化EAM大鼠模型左室心功能，但其详细机制尚不清楚，是进一步研究的方向。

参考文献

[1]SHALEV I,WONG KM,FOERSTER K,et al.The novel CD4+CD25+regulatory T cell effector molecule fibrinogen-like protein 2 contributes to the outcome of murine fulminant viral hepatitis[J].Hepatology,2009,49(2):387

[2]SHALEV I,LIU Hao,KOSCIK C,et al.Targeted deletion of Fgl2 leads to impaired regulatory T cell activity and development of autoimmune glomerulonephritis[J].J Immunol,2008,180(1):249

[3]ZHENG ZZ,WANG L,WU YP,et al.Fibrinogen-like protein 2 gene silencing activates angiopoietin/Tie system and induces myocardial microvascular endothelial cells proliferation and cell migration[J].Biomedical Research,2012,23(1):37

[4]郑振中,王亮,吴友平,等.慢病毒介导Fgl2基因沉默对心肌微血管内皮细胞Ang-1、Ang-2 mRNA表达及细胞增殖、迁移的影响[J].郑州大学学报(医学版),2013,48(1):28

[5]ZHENG ZZ,YU YF,LIANG J.Fibrinogen-like protein 2 gene silencing inhibits cardiomyocytes apoptosis,improves heart function of streptozotocin-induced diabetes rats and the molecular mechanism involved[J].Biosci Rep,2015,35(3):e00219

[6]郑茜,唐其柱,彭晟,等.APRIL在实验性自身免疫性心肌炎大鼠心肌组织中的表达及意义[J].武汉大学学报(医学版),2008,29(2):193

[7]MAISCH B,RICHTER A,SANDMÖLLER A,et al.Inflammatory dilated cardiomyopathy(DCMI)[J].Herz,2005,30(6):535

[8]DELISA F,ZIYA K,GEOFFREY R,et al.From infection to autoimmunity[J].J Autoimmun,2001,16(3):175

[9]KNACKSTEDT MK,ZENCLUSSEN AC,HERTWIG K,et al.Th1 cytokines and the prothrombinase Fgl2 in stress-triggered and inflammatory abortion[J].Am J Reprod Immunol,2003,49(4):210

[10]BOJUNGA J,NOWAK D,MITROU PS,et al.Antioxidative treatment prevents activation of death-receptor- and mitochondrion-dependent apoptosis in the hearts of diabetic rats[J].Diabetologia,2004,47(12):2072

中图分类号Q782

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.012

*国家自然科学基金项目30960119，81260044；江西省科技支撑计划项目2010BSA12000