柯萨奇病毒B3诱导的病毒性心肌炎C57BL/6J小鼠模型的建立

赵小建，张洁钰，杨　帆，王　丽，张真真，唐　琳，赵洛沙

郑州大学第一附属医院心内科 郑州 450052



柯萨奇病毒B3诱导的病毒性心肌炎C57BL/6J小鼠模型的建立

赵小建，张洁钰，杨帆，王丽，张真真，唐琳，赵洛沙#

郑州大学第一附属医院心内科 郑州 450052

关键词柯萨奇病毒B3；病毒性心肌炎；C57BL/6J小鼠；动物模型

摘要目的：建立由柯萨奇病毒B3(CVB3)Nancy株诱导的病毒性心肌炎(VMC) C57BL/6J小鼠模型。方法：4周龄、6周龄C57BL/6J小鼠各50只，每个年龄组随机选取15只作为对照(腹腔注射PBS)，剩余35只腹腔接种含CVB3 Nancy株的病毒悬液(1×105 PFU/只)，于感染后第14天取心脏，行 HE染色和CD3、CD45免疫组化染色，进行病理学评价，检测血清白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平，并做心肌组织中病毒滴度检测，采用Western blot法检测磷酸化AKT、IkBα、GSK3β的表达。结果：4周龄小鼠造模过程中有19只(54.3%)死亡；与对照小鼠比较，模型小鼠心肌呈现弥漫性炎性细胞浸润和片状心肌细胞变性坏死, CD3、CD45阳性细胞弥漫浸润于心肌间质，血清IL-1β、TNF-α水平明显升高(P<0.05)，心肌组织中磷酸化AKT、IkBα、GSK3β表达增高(P<0.05)。6周龄小鼠造模过程中有3只(8.6%)死亡，模型小鼠心肌组织中炎症反应轻于4周龄模型小鼠(P<0.05)。结论：成功建立了 VMC 的C57BL/6J小鼠模型, 4周龄C57BL/6J小鼠更适用于模型的建立。

Establishment of C57BL/6J mouse myocarditis model induced by coxsackievirus B3

ZHAOXiaojian，ZHANGJieyu，YANGFan，WANGLi，ZHANGZhenzhen，TANGLin，ZHAOLuosha

DepartmentofCardiology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

Key wordscoxsackievirus B3;viral myocarditis;C57BL/6J mouse;animal model

AbstractAim: To establish a C57BL/6J mouse model of myocarditis induced by coxsackievirus B3(CVB3).Methods: A total of 50 male mice with 4-week-age or 6-week-age were divided into two groups: the control(n=15) were injected via intraperiton with PBS, and the model group(n=35) were injected via intraperiton with 1×105PFU CVB3. After 14 d, mice hearts were harvested for HE staining and CD3,CD45 immunohistochemistry staining，the serum levels of IL-1β,TNF-α were assayed by ELISA, the expressions of p-AKT，p-IkBα and p-GSK3β were detected by Western blot.Results: 4-week-age model group came out with a higher mortality(19/35,54.3%), HE staining showed that a great deal of inflammatory cells concentrated in the adjacent area around the myocardiocytes,which was consistent with the finding that many CD3,CD45 positive macrophages gathered in the necrosis area，TNF-α and IL-6 level were increased(P<0.05),p-AKT,p-IκBα and p-GSK3β protein expression increased(P<0.05). While the 6-week-age model group showed a lower mortality(3/35,8.6%),and the immune response to CVB3 infection was milder than 4-week-age model group(P<0.05).Conclusion: A C57BL/6J mouse model of myocarditis induced by CVB3 is successfully established，and 4-week-age mice are recommended for this model.

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是临床常见的心血管系统感染性疾病，其发病以青少年为主， 其中肠道病毒尤其是柯萨奇病毒B3(coxsackievirus B3， CVB3) 是引起 VMC 的最常见原因[1]。一个可靠和稳定的动物模型是心肌炎发病机制研究、 心肌炎治疗及药物筛选不可缺少的实验工具。VMC模型现主要有巨细胞病毒诱导的大鼠模型及柯萨奇病毒诱导的小鼠模型。因雄性BALB/c小鼠对柯萨奇病毒相对易感，所以国内VMC模型多采用6～8周龄雄性BALB/c小鼠[2]。同源近交雄性C57BL/6J小鼠发病程度不显著，通常不推荐造模[3-5]。随着基因打靶、TALAN及Cas9系统的应用[6]，研究某一特定基因对疾病的作用得以实现，其中以C57BL/6J小鼠为遗传背景的基因工程小鼠在探讨疾病的分子机制方面发挥了关键作用[7]。该研究旨在建立以C57BL/6J小鼠为对象、由CVB3 Nancy株诱导的VMC模型及其评价体系，以期为后续VMC发病机制及防治靶点的研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料同源近交雄性C57BL/6J小鼠购于河南省实验动物中心，其中4周龄小鼠50只(体重13.5～15.0 g)，6周龄小鼠50只(体重18.5～20.0 g)。CVB3 Nancy 株购于武汉大学典藏中心，经Hela细胞和小鼠心肌传代、滴定，并建立终浓度为 1×106PFU/mL(PFU：空斑形成单位)的病毒库。

1.2小鼠VMC模型的建立每个年龄组小鼠各随机选取35只(模型组)腹腔注射1×106PFU/mL 的CVB3病毒液0.1 mL；余15只作为对照，均注射等体积的PBS。

1.3小鼠一般情况观察和记录以病毒接种日为第0天，接种后每日观察小鼠日常活动情况、毛皮颜色、饮食摄入量和排泄情况，记录小鼠死亡时间。于第14天处死小鼠并取材，记录小鼠体重(BW)，心脏质量(HW)，计算心脏指数(HW/BW)。 同时采用空斑形成单位法，对模型小鼠进行心肌组织病毒滴度测定，病毒滴度以每g心肌组织中PFU数目的对数值表示。

1.4心脏病理组织学观察将小鼠心脏置于氯化钾液中使其停跳于舒张期后，于中性福尔马林中固定，于距心底1/3处横切为二，取心尖部分脱水包埋，常规制片，行HE及PSR染色，检测炎症浸润和胶原沉积。根据炎症浸润面积，病理评分分为4级[8]：0 级，无浸润；1 级，浸润面积<25%；2级，浸润面积 25%～；3 级，浸润面积50%～；4 级，浸润面积≥75%。

1.6血清炎症因子IL-1β、TNF-α测定第14天处死小鼠前眶后静脉采血并离心取上清，采用双抗体夹心ELISA法测定血清IL-1β、TNF-α水平。IL-1β、TNF-α试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供，操作步骤按试剂盒说明进行。在 Bio-rad酶标仪450 nm处读取光密度值,根据标准品浓度和光密度值计算各炎症因子的质量浓度。

1.8统计学处理采用SPSS 21.0 进行数据处理。两组间各指标的比较采用两独立样本t检验，检验水准α=0.05。

2结果

2.1小鼠一般情况及心肌组织病毒滴度4 周龄小鼠接种CVB3后， 第2天开始出现进食量和进水量减少, 以后出现消瘦、 耸毛、 皮毛紊乱无光泽、 活动减少、蜷缩驼背、 对刺激反应淡漠或易激惹,体重明显下降， 第4天开始出现死亡， 死亡高峰期出现在第7～10天, 至第14天共死亡19只(54.3%)。6周龄小鼠接种CVB3 后，第4天开始出现耸毛、皮毛无光泽、蜷缩驼背、活动减少、对刺激反应不敏感或易激惹，第6 天开始出现死亡，至第14天共死亡3只(8.6%)。对照小鼠均未见异常行为变化及死亡。第14天，模型小鼠心脏指数均较对照升高，结果见表1。对照小鼠心肌CVB3检测均为阴性，模型小鼠均为阳性。4周龄模型小鼠心肌组织病毒滴度为(4.113±0.228)，6周龄模型小鼠为(3.584±0.202)，4周龄模型小鼠较高(t=8.191，P<0.001)。

2.2小鼠心脏病理组织学表现大体观察，4周龄模型小鼠心脏外膜肉眼可见大量白色点状坏死组织

以及出血点， 6 周龄模型小鼠心脏外膜肉眼可见少量白色点状坏死组织及出血点。HE染色可观察到，4周龄模型小鼠心肌组织中存在弥漫性炎性细胞浸润和大量心肌细胞坏死，炎性细胞浸润分布在溶解坏死的心肌周围，病理评分(3.314±0.602)；6 周龄模型小鼠心肌炎性病变较4周龄模型小鼠轻，可见心肌细胞肿胀、血管扩张，淋巴细胞局灶性浸润，心肌组织病理评分(2.438±0.504)，低于4周龄模型小鼠(t=5.312，P<0.001)。PSR染色可见, 4周龄模型小鼠红色胶原分布在心肌坏死灶处，6 周龄模型小鼠可见少量胶原分布在心肌坏死灶边。对照小鼠均无异常表现，大体观和镜下观察均为正常心肌结构。见图1。

表1　小鼠心脏指数的变化　mg/g

1：4周龄对照小鼠；2:6周龄对照小鼠；3：4周龄模型小鼠；4:6周龄模型小鼠。图1　小鼠心脏大体(A)观及心肌HE(B，×100)、PSR(C，×100)染色结果

2.3小鼠心肌组织中CD3、CD45的表达见图2。4周龄模型小鼠心肌组织中可见 CD3、CD45 阳性细胞分布于心肌间质伴炎症分布区；6周龄模型小鼠CD3、CD45阳性细胞也可见散在分布于较轻的炎症分布区。

1：CD45；2：CD3；A：4周龄对照小鼠；B:6周龄对照小鼠；C：4周龄模型小鼠；D:6周龄模型小鼠。图2　心肌组织中CD45、CD3的表达(×100)

2.4小鼠血清炎症因子水平模型小鼠血清IL-1β、TNF-α均较对照小鼠显著升高，且4周龄模型小鼠高于6周龄模型小鼠(表2)。

表2　小鼠血清IL-1β、TNF-α水平的比较 　 μg/L

*:与6周龄模型小鼠比较，P<0.05。

2.5小鼠心肌组织中p-AKT、p-IkBα、p-GSK3β的表达见图3、表3。与对照小鼠相比，模型小鼠p-AKT、p-IkBα、p-GSK3β表达均增高。

图3　Western blot结果

组别4周龄np-AKTp-IkBαp-GSK3β6周龄np-AKTp-IkBαp-GSK3β对照组151.002±0.0061.050±0.0131.041±0.001151.053±0.0431.002±0.0460.998±0.006模型组162.503±0.4612.051±0.0441.703±0.009321.182±0.0921.250±0.0391.240±0.002t124.934838.702270.0145.151191.308255.794P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

3讨论

尽管国外报道[9]以C57BL/6J小鼠为遗传背景建立VMC模型主要采用CVB3突变株，其致病力及侵袭力较Nancy株明显增强，可成功建立C57BL/6J小鼠VMC模型，但鉴于国内外CVB3诱导的VMC模型建立绝大多数选取标准株Nancy株，因此此次研究也选用CVB3 Nancy株。作者分别对4周龄和6周龄C57BL/6J雄性小鼠腹腔注射CVB3。4周龄小鼠接种后第2天即开始出现进食量和进水量减少,第3天出现消瘦,耸毛,皮毛紊乱无光泽,活动减少,蜷缩驼背,对刺激反应淡漠或易激惹,体重出现明显下降，第4天开始出现死亡，第14天死亡率达54.3%；小鼠心肌显示弥漫性炎性细胞浸润和大量心肌细胞坏死，炎性细胞浸润分布在溶解坏死的心肌周围，病理评分明显高于对照；CD3、CD45 阳性细胞分布于心肌间质伴炎症分布区；血清IL-1β、TNF-α水平较对照明显升高；心肌病毒滴度检测为阳性。以上结果表明 CVB3 Nancy株感染4周龄C57BL/6J小鼠诱发了VMC并造成心肌损伤，模型建立成功，且与前人报道[10-13]的BALB/c小鼠模型特点相似。6周龄小鼠感染CVB3后，心肌组织病理表现、血清炎症因子水平均较低，提示炎症反应较轻，模型建立不理想，这可能与成年小鼠免疫功能及机体发育相对成熟有关，更不易被CVB3感染。雄性C57BL/6J小鼠一般在45～60日龄达到性成熟，70～80日龄身体发育成熟[14]。4周龄小鼠仍处于幼年，免疫功能及机体发育尚不成熟，更易受CVB3感染，产生更严重的炎症反应及心肌损伤。该研究与国内报道[15]的18～20 g体重(或者5～6周龄)C57BL/6J小鼠更适合建立急性VMC模型的结论不一致。但作者认为，6周龄小鼠虽然存活率较高，但所诱导的心肌炎症反应较轻，不适合应用于VMC模型构建，或者更适合CVB3反复感染致扩张性心肌病模型的构建。

以往的研究常常只强调心肌细胞坏死在心肌疾病中的作用。VMC时存在细胞因子平衡紊乱, TNF-α、IL-1β、IL-6基因启动子含有κB位点，TNF-α、IL-1β与细胞膜表面受体结合后,可激活IκB激酶复活物,使IκBα磷酸化降解,NF-κB 激活，导致炎症基因的表达增强及细胞凋亡发生[16]。前人报道[17-18]CVB3可使PI3K-Akt-mTOR信号通路过度活化，可能通过PRAS40和PRR5L结合mTORC2加速细胞的凋亡，也可通过PI3K-Akt-GSK3β信号通路促使心肌成纤维细胞GSK-3β mRNA和蛋白表达增加，从而促进心肌成纤维细胞增殖。心肌成纤维细胞的增殖可造成心肌纤维化、心肌重塑及心肌肥厚，导致扩张型心肌病。该实验Western blot结果显示，VMC模型小鼠心肌组织中p-IκBα、p-AKT表达上调，提示NF-κB、PI3K-Akt-GSK3β信号通路激活，进一步提示心肌细胞炎症反应级联放大、凋亡坏死加剧及心肌纤维化通路激活。4周龄模型小鼠在感染CVB3第14天已经出现心肌局部胶原结缔组织增生，提示心肌纤维化病变在VMC急性期已经开始，因此应在VMC急性期早期应用药物治疗。

作者总结成功建立VMC模型主要注意事项有：因病毒活性呈指数衰减，故病毒应冰浴溶解后立即腹腔注射；小鼠周龄与易感性高度相关，但与注射的CVB3活性单位的量相比，病毒易感性对模型的影响更大。该研究不足之处在于未能提供数据证明不同病毒剂量对模型的影响，后续的研究中将详细探讨腹腔注射病毒剂量对模型的影响及病毒在体内的复制播散轨迹，以及C57BL/6J小鼠VWC模型的病毒学、病理生理学及分子生物学机制。

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中图分类号R373.2+3

#通信作者，女，1956年4月生，硕士，主任医师，研究方向：心血管内科疾病，E-mail：zhaoluosha@126.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.019