microRNA-151检测用于评价卵巢癌铂类药物疗效的临床价值

苏　纯，李巧云，范　梅，陆　林

1)郑州大学第五附属医院妇产科 郑州 450052　2)郑州大学第一附属医院超声科 郑州 450052　3)郑州大学第三附属医院放射科 郑州 450052

△女，1971年6月生，本科，副主任医师，研究方向：妇科肿瘤,E-mail：suchun5h@163.com



microRNA-151检测用于评价卵巢癌铂类药物疗效的临床价值

苏纯1)△，李巧云1)，范梅2)，陆林3)

1)郑州大学第五附属医院妇产科 郑州 4500522)郑州大学第一附属医院超声科 郑州 4500523)郑州大学第三附属医院放射科 郑州 450052

△女，1971年6月生，本科，副主任医师，研究方向：妇科肿瘤,E-mail：suchun5h@163.com

关键词卵巢癌；化疗；microRNA；Bcl-2

摘要目的：探讨microRNA检测用于评价卵巢癌患者铂类药物疗效的临床价值。方法：研究纳入接受顺铂化疗的初治卵巢癌患者88例，根据ATP-TCA结果分为敏感组(45例)和耐药组(43例)。microRNA微阵列分析2组患者血清microRNA表达的差异，并使用qRT-PCR加以验证。绘制ROC曲线，分析microRNA-151高表达与卵巢癌化疗不敏感现象的关系。体外培养SKOV3细胞并转染pcDNA3.1-microRNA-151或pcDNA3.1空质粒，使用3 μmol/L顺铂处理细胞48 h，计算细胞存活率，同时采用qRT-PCR及Western blot检测microRNA-151对细胞Bcl-2表达的影响。结果：与敏感组患者相比，耐药组患者中有5种microRNA表达上调，5种microRNA表达下调。microRNA-151水平的检测对于评价卵巢癌患者铂类药物疗效有临床价值(AUC=0.719, 95%CI=0.607～0.831)，高microRNA-151水平的患者发生对铂类药物不敏感的风险较高。高表达microRNA-151可减弱SKOV3细胞对铂类药物的敏感性，提高Bcl-2的表达(P均<0.05)。结论：检测microRNA-151水平可以评估卵巢癌患者对铂类药物的敏感性。

Clinical value of microRNA-151 in evaluating effect of platinum drugs on patients with ovarian cancer

SUChun1),LIQiaoyun1),FANMei2),LULin3)

1)DepartmentofGynecologyandObstetrics,theFifthAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)DepartmentofUltrasound,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500523)DepartmentofRadiology,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsovarian cancer;chemotherapy;microRNA;Bcl-2

AbstractAim: To investigate the clinical value of microRNA-151 in evaluating effect of platinum drugs on patients with ovarian cancer.Methods: Eighty-eight ovarian cancer patients treated with platinum drugs were allocated into sensitive group and insensitive group according to the result of ATP-TCA test. MicroRNA microarray was used to detect the change of microRNA expression between two groups and the results was proven by qRT-PCR. The clinical value of detecting microRNA-151 was estimated by ROC curves. Furthermore, SKOV3 cells were cultured in vitro and transfected with pcDNA3.1-microRNA-151 or empty pcDNA3.1. Non-transfected SKOV3 cells and transfected SKOV3 cells were treated with 3 μmol/L cisplatin for 48 h and CCK-8 assay was used to calculate the viability of different cells. Finally, the Bcl-2 expression change induced by microRNA-151 was confirmed by qRT-PCR and Western blot.Results: Compared with sensitive group, in insensitive group,5 kinds of microRNA expression were decreased and 5 were increased.ROC curves supported that microRNA-151 had effectively clinical value to assess the sensitivity of ovarian cancer patients to platinum drugs(AUC=0.719, 95%CI=0.607-0.831). High-expressed microRNA-151 was a risk factor for ovarian cancer patients to induce resistance to platinum drugs; moreover, high-expressed microRNA-151 could induce the resistance of SKOV3 cells to platinum drugs and increase Bcl-2 expression(P<0.05).Conclusion: MicroRNA-151 could be used to evaluate the sensitivity of ovarian cancer patients to platinum drugs.

基于铂类药物的联合化疗方案已经成为临床上治疗实体肿瘤的成熟方案，其在卵巢癌的治疗中效果较为明确[1-2]。然而，不同个体对铂类药物的敏感性有较大差异，一些患者对铂类药物的敏感性达不到预期[3]。因此对患者铂类药物敏感性的评估较为重要。microRNA检测技术已经较为成熟，且对于microRNA与肿瘤化疗敏感性的研究[4]已经有所报道。如有研究[5]发现，microRNA-221和microRNA-222的高表达介导细胞对阿霉素的耐药性。microRNA-429和microRNA-196则与结肠癌一线化疗药物的治疗效果密切相关[6]。还有研究[7]指出，在卵巢癌中存在microRNA表达谱的差异，且这些microRNA的表达变化可能预示卵巢癌的发生和发展。该研究旨在探讨microRNA表达差异与铂类药物治疗敏感性的关系及机制。

1对象与方法

1.1研究对象研究纳入2013年1月至2014年4月于郑州大学第五附属医院就诊及治疗的经病理学确诊的卵巢癌患者88例，年龄35～75岁，中位年龄51岁。分期参照国际妇产科联盟制定的标准，其中Ⅰ～Ⅱ期10例，Ⅲ～Ⅳ期78例。所有患者术前未经过化疗、放疗以及相关的内分泌或生物治疗。患者半年内不曾服用免疫调节制剂和激素类药物。Ⅰ期患者接受合理分期手术，Ⅱ～Ⅳ期患者接受细胞减灭术。所有患者术后均接受紫杉醇联合顺铂为主的化疗方案3～6个周期。术中留取新鲜癌组织标本用于药物敏感性的检测。血清标本于术前采集并常规低温保存。

1.2研究对象对顺铂敏感性的检测采用ATP-TCA体外药敏检测法对患者组织标本进行顺铂药敏检测，严格按照试剂盒中提供的说明书进行操作。主要步骤为：剪碎术中留取的新鲜癌组织标本，组织解离酶消化酶解后，离心并制备细胞悬液。将细胞悬液加入含0.0%、12.5%、25.0%、50.0%、100.0%血浆峰值浓度的顺铂无血清培养基中培养1周，同时设置对照，即未加药物的阴性细胞对照及未加细胞的空白对照。培养1周后，加入ATP提取液提取细胞中的ATP，加入荧光素-荧光酶素试剂，检测荧光值，以反映肿瘤细胞的活性。

1.3microRNA微阵列分析采集患者术前静脉血标本并分离血清， 采用microRNA 芯片(丹麦Exiqon公司)进行microRNA 微阵列分析。采用Trizol试剂提取总RNA，采用microRNA分离试剂盒(美国Invitrogen公司)分离并纯化microRNA。用T4 RNA连接酶(美国Invitrogen公司)对microRNA进行荧光标记，将带有标记的microRNA与微阵列芯片杂交，杂交时间为12 h。杂交结束后，采用Luxscan10K/A扫描系统(博奥生物有限公司)进行芯片扫描，并用Significance Analysis of Microarrays 2.0软件进行结果分析。

1.4实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证microRNA表达变化采用Pure Mini microRNA提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)分离提取样本中的microRNA，采用TaqMan microRNA Reverse Transcription试剂盒(美国Life Technologies公司)反转录micorRNA生成cDNA，反转录体系和条件参考说明书。qRT-PCR采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ Kit[宝生物工程(大连)有限公司]在7900HT Fast RT-PCR System(美国Life Technologies公司)中进行。反应体系参照试剂盒说明书。hsa-microRNA-151引物序列为：5’-CGCCTAGACTGAAGCTCCT-3’(上游)，5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(下游)。hsa-microRNA-451引物序列为：5’-ACCGUUAC CAUUACUGAGUU-3’(上游)，5’-CUCAGUAAUG GUAACGGUUUUU-3’(下游)。采用microRNA-16作为内参，其引物序列为：5’-CGCGCTAGCAGCACGTA AAT-3’(上游)，5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(下游)。采用2-ΔCt计算hsa-microRNA-151 和hsa-microRNA-451的表达水平，其中ΔCt=Ct目标-Ct内参。

1.5microRNA与卵巢癌患者化疗敏感性的关系

根据ATP-TCA药敏结果将患者分为顺铂敏感组和耐药组。绘制ROC曲线验证microRNA检测评估敏感程度的效能，通过单因素以及logistic回归分析确定变化的microRNA水平与疗效的关系。

1.6SKOV3细胞的培养与microRNA的转染卵巢癌SKOV3细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心细胞库，培养于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基(美国Gibco公司)，培养环境为体积分数5%CO2、37 ℃。采用由上海吉玛公司设计并构建的pcDNA3.1-microRNA-151表达质粒转染SKOV3细胞，同时以转染pcDNA3.1空质粒的细胞作为阴性对照。采用LipofectamineTM2000转染试剂盒(美国Invitrogen公司)进行转染，方法参考试剂盒说明书。

1.7microRNA-151转染对SKOV3细胞顺铂敏感性的影响细胞分组：未经任何处理的SKOV3细胞作为对照组、3 μmol/L顺铂处理的未经转染的SKOV3细胞、3 μmol/L顺铂处理的转染pcDNA3.1-microRNA-151的SKOV3细胞以及3 μmol/L顺铂处理的转染pcDNA3.1空质粒的SKOV3细胞。在96孔板中接种各组细胞悬液(100 000个/孔)，常规培养48 h，向每孔加入10 μL CCK-8试剂(上海博谷生物科技有限公司)，继续培养4 h，用酶标仪测定450 nm处各组细胞的吸光度，按照公式细胞存活率=(实验组吸光度/对照组吸光度)×100%计算各组细胞的存活率。实验重复3次。

1.8microRNA转染对SKOV3细胞Bcl-2表达的影响细胞分为转染pcDNA3.1-microRNA-151组、转染pcDNA3.1空质粒组和未转染组，转染方式同1.6。收集处理后的SKOV3细胞，Trizol提取各组细胞的总RNA。采用ImProm-Ⅱ反转录试剂盒[普洛麦格(北京)生物技术有限公司]对提取出的总RNA进行反转录，以合成cDNA。反转录体系参照试剂盒提供的说明书。采用GO Taq qPCR Master Mix试剂盒[普洛麦格(北京)生物技术有限公司]对合成的cDNA进行PCR扩增。Bcl-2上游引物为5’-TTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3’，下游引物为5’-TG CATATTTGTTTGGGGCAGG-3’；GAPDH上游引物为5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物为5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。反应体系和条件参照试剂盒说明书。采用2-ΔΔCt法分析各样本Bcl-2 mRNA的表达情况。实验重复3次。

1.9统计学处理采用SPSS 17.0进行数据处理。敏感组和耐药组microRNA的表达水平以中位数表示，比较采用Mann-Whitney秩和检验；各组细胞对顺铂敏感性以及Bcl-2表达水平的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。检验水准α=0.05。

2结果

根据ATP-TCA结果，可将所有患者分为顺铂敏感组和耐药组。其中敏感组45例，年龄35～70岁，中位年龄53岁；耐药组43例，年龄40～75岁，中位年龄52岁。

2.1microRNA微阵列分析结果与敏感患者相比，耐药患者血液标本中共有10种microRNA出现了差异表达，其中5种出现降低，5种出现增高，且hsa-microRNA-415的降低程度最为显著，hsa-microRNA-151的增高程度最为显著，见表1。

表1　敏感组和耐药组间10种microRNA信号强度比较

2.2qRT-PCR对hsa-microRNA-415和hsa-microRNA-151差异表达的验证敏感组和耐药组hsa-microRNA-415表达的中位数分别为3.410(0.192～12.381)与3.000(0.262～9.000)，差异无统计学意义(Z=0.667，P=0.611);hsa-microRNA-151表达的中位数分别为5.438(0.910～13.051)与 6.890(0.482～16.213)，差异有统计学意义(Z=2.530，P=0.032)。

2.3microRNA-151与卵巢癌患者对铂类药物敏感性的关系ROC曲线下面积(AUC)为0.719(95%CI=0.607～0.831)，最佳截断值为6.05，对应的敏感性为66.7%，特异度为89.1%，见图1。以6.05为界限，将患者microRNA-151水平<6.05划分为低microRNA-151组，其余患者划分为高microRNA-151组，2组患者的治疗效果见表2。Logistic回归分析证实高microRNA-151水平是患者发生化疗不敏感现象的独立危险因素，见表3。

2.4microRNA-151高表达抑制SKOV3细胞对顺铂的敏感性结果见表4。

2.5microRNA-151高表达诱导SKOV3细胞Bcl-2的高表达结果见表4、图2。

图1　microRNA-151评估铂类药物耐药的ROC曲线

例

OR=4.139,95%CI=1.713～10.454,χ2=10.234,P<0.001。

表3　microRNA-151预测卵巢癌患者

表4　microRNA-151转染对SKOV3细胞存活率及Bcl-2 mRNA表达水平的影响

*：与其他2组比较，P<0.05。

A：正常SKOV3细胞；B：转染pcDNA3.1-microRNA-151质粒的SKOV3细胞；C：转染pcDNA3.1空质粒的SKOV3细胞。图2　microRNA-151高表达对SKOV3细胞Bcl-2表达的影响

3讨论

卵巢癌是致死率较高的妇科恶性肿瘤，70%的患者在明确诊断时已为晚期。目前，临床治疗卵巢癌的方案是肿瘤细胞减灭术联合化疗。化疗的常用方案是以铂类为主的联合化疗，因为铂类药物具有费用低、不良反应少、效果明确且抗癌谱广泛的优点[8]。顺铂是常用的铂类药物，报道[9]称以顺铂为主的联合化疗的完全缓解率应为60%左右，但实际的临床效果却低于此。越来越多的证据[10]表明microRNA的差异表达与肿瘤细胞对化疗药物的敏感性有关。通过microRNA芯片检测，作者发现了对铂类药物治疗不敏感的患者存在microRNA-151的高表达，且microRNA-151转染可降低SKOV3细胞对顺铂的敏感性。

microRNA影响化疗敏感性的机制较复杂[11]。该研究选取凋亡调控因子Bcl-2作为研究点。大量研究[12-14]表明Bcl-2的表达与肿瘤对化疗药物的敏感性有关，Bcl-2高表达时，氟尿嘧啶、长春新碱、表阿霉素、奥沙利铂对肿瘤细胞的抑制率明显降低。该研究发现microRNA-151的转染可导致SKOV3细胞Bcl-2的表达显著增高，因此推测microRNA-151表达增高可能增加Bcl-2的表达水平，减少凋亡，从而降低卵巢癌患者对铂类药物的敏感性。当然，该研究未能阐述microRNA-151如何增加Bcl-2的表达，也未能阐述除Bcl-2外还有哪些凋亡调控因子与microRNA-15有关，这有待于进一步研究。

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中图分类号R737.31

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.021