药用植物中鲨烯环氧酶基因的研究进展

许　燕,赵　爽,邸　亮

(1.云南中医学院药学院,云南 昆明　650500; 2.安徽中医药大学第一附属医院药学部,安徽 合肥　230022)



药用植物中鲨烯环氧酶基因的研究进展

许燕1,赵爽1,邸亮2

(1.云南中医学院药学院,云南 昆明650500; 2.安徽中医药大学第一附属医院药学部,安徽 合肥230022)

摘要：鲨烯环氧酶(SE)存在于内质网的微粒体中,在鲨烯转变为环氧化鲨烯的生物过程中作为生物催化剂起催化作用。而环氧化鲨烯是从鲨烯生成环阿屯醇、香树素、羊毛甾醇等的过程中重要的中间产物。SE的活性决定了环氧化鲨烯的生物合成的效率,继而,以环氧化鲨烯作为前体的各类甾体皂苷、三萜皂苷、甾醇等化合物的生物合成也随之受其影响,后续产物的产量取决于它的含量和活性。因此SE被认为是甾体皂苷生物合成途径中的一个非常重要的调控酶,已在多种植物中克隆出并进行了初步功能鉴定。该文概述几个重要药用植物的SE基因的克隆及原核表达,为从其他药用植物中克隆SE基因提供一定的参考依据及方法思路。

关键词：鲨烯环氧酶；基因克隆；原核表达

鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)又称鲨烯单加氧酶,存在于内质网的微粒体中,是催化鲨烯(角鲨烯)转变为环氧化鲨烯反应的生物催化剂。环氧化鲨烯是从鲨烯生成羊毛甾醇、环阿屯醇、香树素等过程中的重要中间产物。SE的活性决定了环氧化鲨烯的生物合成的效率,继而,以环氧化鲨烯作为前体的各类甾体皂苷、三萜皂苷、甾醇等化合物的生物合成也随之受其影响,后续产物的产量取决于它的含量和活性。因此SE被认为是甾体皂苷生物合成途径中的一个非常重要的调控酶。三萜皂苷作为一类重要的植物次生代谢产物广泛分布于各种植物之中,尤其以双子叶植物中分布为最多,具有重要的生物学意义。三萜皂苷的结构具有多样性特点,生物活性也具多样性,具有广泛的药理作用和重要的商业价值。一些珍贵药用植物中富含三萜皂苷且多数为其主要的药用有效成分,如人参三萜皂苷、三七三萜皂苷、重楼三萜皂苷、黄芪三萜皂苷等[1]。而在这些药用植物中三萜皂苷的合成途径中的关键酶及其表达水平决定了三萜皂苷的含量和组成的变化[2]。

目前公认的合成三萜皂苷元的主要途径是MVA途径(甲戊二羟酸途径)[3-7],其生物合成的过程见图1,相关英文缩略词注解见表1。

近几年来,植物次生代谢产物如三萜皂苷类生物合成的分子机制及其表达量的调控已经成为植物次生代谢研究的前沿和热点。而三萜皂苷的生物合成过程中不同分支点的重要酶已成为热点中的热点。鲨烯环氧酶将鲨烯催化生成单氧态氧化鲨烯[8],单氧态氧化鲨烯在在紫外线和强光刺激作用下生成2,3-氧化鲨烯。2,3-氧化鲨烯再经过一系列生化反应后形成三萜皂苷元[9]。Devarenne等[10]研究发现：三萜皂苷的生成量随着体外诱导SE的表达量增加而增加,而降低SE的表达量,三萜皂苷的合成则受到抑制。SE可以促进三萜皂苷的释放,增加三萜皂苷的合成量[11]。Choi等[12]也通过基因微阵列发现在人参发根的表达序列标记中,SE等基因与三萜皂苷合成量高度相关,SE基因被茉莉酸甲酯(MeJA)诱导而高表达时三萜的合成量增加；而SE基因在细胞分裂素活化蛋白激酶(MAPK)的作用下发生磷酸化时三萜合成量就会大幅度降低[13]。调控SE的活性能够直接影响到环氧化鲨烯的生物合成,继而以环氧化鲨烯作为前体的各类甾体皂苷、三萜皂苷、甾醇等化合物的生物合成也随之受其影响,因此SE被认为是甾体皂苷生物合成途径中的一个非常重要的调控酶。

图1　MVA途径(mevalonic acid pathway,甲戊二羟酸途径)

缩写中文全称英文全称MVA甲羟戊酸MevalonicacidHMG-CoA3-羟基-3-甲基戊二酸单酰-CoA3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoAHMGRHMG-CoA还原酶3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoAreductaseIPP异戊二烯焦磷酸IsopentenylpyrophosphateDPP3,3-二甲基丙烯焦磷酸酯dimethylallyldiphosphateGPP焦磷酸牛儿酯geranylpyrophosphateFPP法呢基焦磷酸酯farnesylpyrophosphateFPS法呢基焦磷酸合酶farnesylpyrophosphatesynthaseSS鲨烯合酶squalenesynthaseSQ鲨烯squaleneSE鲨烯环氧酶squaleneepoxidase

通过NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在GENE条目下搜索Squalene epoxidase,得到429个条目,其中1个来自于病毒,5个条目来自于细菌,423个条目来自于262个真核生物物种。目前研究最多的领域在真核生物的绿色植物中陆生的维管束植物,NCBI收录了来自其43个物种的190个条目。下面介绍几种药用植物的SE基因的克隆与表达方法。

1人参SE基因的克隆与表达

人参(PanaxginsengC.A.Mey)是多年生草本植物,属五加科。刘宁等[14-15]提取人参根组织须根总RNA,反转录为cDNA(互补DNA)后并以其为模板对SE基因进行PCR(polymerase chain reaction,聚合酶链式反应)扩增。设计引物添加NcoⅠ和NotⅠ酶切位点。PCR反应条件为：94°C 5 min 1个循环；94°C 1 min、56.2°C 30 s、72°C 1 min 30个循环；72°C 10 min 1个循环。PCR产物经纯化后插入原核表达载体构建重组质粒。携带着目的基因的重组质粒可通过酶切后测序的手段来鉴定接入的基因是否正确,确定为目的基因后转入Rosetta大肠杆菌,经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达后,进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测,并利用LC-MS(液相色谱—串联质谱联用技术)检测SE的含量。结果获得全长为1 611 bp的SE基因cDNA,编码537个氨基酸,在NCBI中进行同源性比对,其核苷酸同源性和氨基酸序列同源性极高均为99%以上。他们经LC-MS检测达玛烯二醇,发现其生成量随着SE的增加而增加,证明SE的含量与人参皂苷生成量相关。

人参皂苷作为人参的主要成分,近年来广泛应用于医疗卫生保健以及化妆品产业,需求量极大。胡薇等[15]的研究发现SE在人参皂苷的生物合成中起着关键性的作用,并且从某种程度上可以说是决定了三萜皂苷的生物合成、控制人参皂苷合成的关键酶之一。所以,通过基因技术提高SE基因的表达量可能是提高人参皂苷产量的有效手段。

2三七SE基因的克隆与表达

三七为五加科植物三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)的干燥根和根茎。李珅[16]首次成功分离三七SE基因cDNA。他从三七的根部提取总RNA,通过RT-PCR法从总RNA中扩增出SE基因的cDNA序列。将该cDNA插入克隆载体,得到重组克隆质粒。以人参的SE cDNA为模板设计引物,在引物5’末端加入酶切位点和相应的保护碱基序列。以重组克隆质粒为模板,扩增SE基因。PCR扩增条件为：94°C 5 min 1个循环；94°C 1 min、56.2°C 30 s、72°C 50 s 30个循环；72°C 7 min 1个循环。得到的三七SE基因含cDNA序列全长为1648 bp,编码537个氨基酸。将获得的SE基因序列片段插入表达载体,构建表达载体并测序,结果显示其读码框架正确后将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)plys感受态细胞,经IPTG诱导表达出SE的融合蛋白。SDS-PAGE结果显示,表达出的蛋白质分子量约为64 kD,与理论分子量64 kD基本相符。

人参补气第一,三七补血第一。三七作为云南白药的主要成分,其功用可用“止血、散瘀、定痛”六个字来概括。随着人们保健意识的提高,三七不仅是伤科金疮药,近年来已逐渐成为家喻户晓的保健食材,搭配药膳食用具有治疗糖尿病和心血管疾病的作用。三七的主要有效成分是三萜皂苷,但在三七中三萜皂苷的含量并不高,并且三七的种植比较困难,限制了三七的药用价值。李坤[16]的研究通过调控三萜皂苷合成的关键酶之一的SE来调控三萜皂苷的合成,从而弥补三七中三萜皂苷的天然不足,对将来通过基因手段提高三七产量有重要意义。

3龙牙楤木SE基因的克隆与表达

龙牙楤木属于五加科楤木属,拉丁学名为Araliamandshrica,多年生落叶小乔木或灌木。由于龙牙楤木与人参同为五加科植物,亲缘关系较近,因此成慧等[17]采用RT-PCR的方法,根据人参SE基因的序列设计引物,并在上下游引物的5’端加酶切位点序列,PCR扩增条件为：94°C 5 min 1个循环；94°C 1 min、58°C 1 min、72°C 2 min 35个循环；72°C 7 min 1个循环。得到的龙牙楤木的SE基因全长为1 682 bp,开放阅读框(ORF) 1 644 bp,编码547个氨基酸。成慧等[17]还成功构建了该基因的植物表达载体pAeSE。

龙牙楤木作为药食两用植物是宝贵的植物资源,近年来国内外市场需求量的剧增,对龙牙楤木掠夺式开发,导致其野生资源濒临灭绝。而成慧等[17]的研究,对于通过生物技术来提高龙牙楤木的产量以缓解医药资源紧缺的现状有重要意义。

4远志SE基因的克隆

远志(PolygalatenuifoliaWilld),又名葽绕、蕀蒬,属芸香目远志科,多年生草本。远志中的有效成分远志酸其合成途径中的关键酶也是SE,赵云生[18]首次对其基因进行了研究。设计了5对简并引物,对远志SE基因进行克隆,得到一条517 bp的片段,在NCBI中通过Blastx比对,该片段属于SE基因片段。根据同科的其他植物的SE基因序列推测,已克隆的远志SE基因片段5'端碱基缺少约1426 bp,3'端碱基缺少约110 bp。他以远志基因组DNA为模板,采用降落PCR反应筛选的最优PCR扩增条件为：95°C 4 min 1个循环；95°C 1 min、55°C 1 min、72°C 2 min 30个循环； 95°C 1 min、40°C 1 min、72°C 2 min 15个循环；72°C 7 min 1个循环。

远志具有安神益智、祛痰、消肿等功效,属我国重点保护的三级野生植物,出口量大,虽然目前已经实现远志的人工种植,但存在重产量轻质量的现象。赵云生[18]的研究,通过对远志SE基因的克隆研究可进一步探求远志酸生物合成的本质,进而推动生物技术在远志高产高质上向可行性的方向发展。

5绞股蓝SE基因的克隆

绞股蓝属于葫芦科、绞股蓝属多年生草质攀援植物,拉丁名为Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino。蒋军富等[19]根据已报道的拟南芥、人参、三七等多种植物的SE基因的 cDNA序列,进行多重比对,在序列保守区域设计简并引物,扩增绞股蓝SE基因的保守区的cDNA序列。PCR扩增条件为：94°C 5 min 1个循环；94°C 40 s、54.1°C 1 min、72°C 90 s 40个循环；72°C 10 min 1个循环。再根据得到SE基因cDNA保守区序列设计RACE(cDNA末端快速克隆的技术)引物进行RACE 反应。得到的绞股蓝SE基因cDNA全长为1 818 bp,编码525个氨基酸。在NCBI上经过Blast比对,该序列与其他已报道的植物的相似性为73%～82%。

绞股蓝在中国主要分布在陕西平利、甘肃康县、湖南、湖北,云南、广西等省,号称“南方人参”,民间称其为神奇的“不老长寿药草”。蒋军富等[19]对其SE基因的cDNA克隆研究,为进一步研究三萜皂苷的生物合成机制及其在提高植物药用价值方面奠定了基础。

6刺五加SE基因的克隆与表达

刺五加属于五加科五加属落叶灌木植物,拉丁名为Eleutherococcussenticosus,其根部和根状茎可入药。邢朝斌等[20]在进行刺五加的SE基因克隆时得到两个SE基因的cDNA序列。他们提取刺五加总RNA并逆转录为cDNA,根据NCBI中收录的与刺五加同科的植物的SE基因cDNA序列设计简并引物,采用RT-PCR法进行克隆,PCR扩增条件为：94°C 4 min 1个循环；94°C 1 min、52.5°C 30 s、72°C 1 min 40 s 35个循环；72°C 10 min 1个循环。得到2个序列不同的SE基因,开放阅读框分别为1 665 bp和1 629 bp,分别编码554和542个氨基酸。通过对两个SE基因的核苷酸和氨基酸之间进行比对以及生物信息学分析,推测这两个SE基因在植物体内可能参与不同的生物反应途径,有着不同的表达模式。

邢朝斌等[20]在克隆刺五加SE基因时得到两组SE基因序列,对于三萜皂苷生物合成途径中关键酶的作用机制及表达模式研究具有重要意义,为日后通过生物技术提高刺五加有效成分产量奠定了基础。

不仅在刺五加中含有两个SE基因的cDNA,牛云云等[21]也从三七转录组的高通量测序结果中经拼接、比对获得两个编码SE的基因。两种SE 同源基因具较高同源性,对其进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR等方法检测其在三七不同组织部位的表达模式,及经茉莉酸甲酯诱导处理后基因的表达模式的变化。结果表明这两种SE基因具不同的表达模式,并推测它们在三七次生代谢产物的合成中可能发挥不同的作用。据此,推断SE 同源基因具有很高的相似性却催化功能不同。

综上所述,SE 基因的拷贝数因物种的差异而不同(表2),植物一般含两个或两个以上类型的SE 基因[22]。在模式植物拟南芥(十字花科)中已发现6 个SE 基因并具有不同的表达模式,其中SE1、SE2、SE3 编码的蛋白已被鉴定为鲨烯环氧酶,具有相应的功能。豆科模式植物蒺藜苜蓿中也发现两种SE[23]。

表2　文中几种药用植物SE基因克隆结果汇总

随着科技的发展以及各个学科间的相互融合,分子生物学、蛋白组学和生物信息学在各个学科领域的广泛渗透和应用,利用组合生物学方法来分析甾体皂苷的生物合成途径是必要手段。深入了解其生物合成途径的关键步骤,找出其中的关键酶及其基因的定位、克隆和高表达,将为利用次生代谢工程技术来提高珍贵或濒危中草药的有效成分含量提供理论依据。如果能从分子水平上实现对甾体皂苷生物合成进行人工调控,可缓解由于过度采挖珍贵药用资源而带来的生态环境问题,成为大规模生产最有效可行的办法。这不仅对于基础研究,而且对于增加有效成分的产量,提高经济效益都有重要意义。本文概述几个重要药用植物的SE基因的克隆及原核表达方式方法,为从其他药用植物中克隆SE基因及其他关键酶基因提供一定的参考依据及方法思路,为次生代谢工程技术在药用植物开发上的应用一定的提供理论依据。

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Research progress on squalene epoxidase gene of the medicinal plant

XU Yan1,ZHAO Shuang1,DI Liang2

(1.SchoolofPharmacy,YunnanUniversityofTCM,Kunming,Yunnan650500,China; 2.DepartmentofPharmacy,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine,Hefei,Anhui230022,China)

Abstract:Squalene epoxidase exists in the microsome of the endoplasmic reticulum,which acts as a bio-catalyst in the process of squalene turning to epoxidation squalene.Epoxidation squalene is an intermediate product generated from the process of squalene producing cycloartenol,amyrin,and lanosterol.The activity of SE determines the effficiency of the biosynthesis of epoxidation squalene,which then affects the speed to synthesize steroid saponin,triterpenoid saponin,and sterol and also the activity and quanlity of them.So SE has been taken as an important regulatory enzyme in the biosynthesis of cycloartenol,which was cloned from several plants and its basic functions were ensured.This article summarizes the cloning of SE genes in some medicinal plants and their prokaryotic expression,provides reference for SE gene cloning in other medicinal plants.

Key words：squalene epoxidase；gene cloning；prokaryotic expression

(收稿日期：2015-10-17,修回日期：2015-12-09)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.003

作者简介：许燕,女,硕士研究生通信作者：赵爽,女,副教授,硕士生导师,研究方向：药用植物资源,E-mail：zm_zs@126.com

基金项目：国家自然科学基金(No 81160502)；云南省自然科学基金(No 2011FZ153)；云南省教育厅自然科学基金(No 2013J040)