卵巢癌组织中microRNA-7表达水平及其临床意义

焦丽敏，梁　进，王　琼，李纪强

(1. 佛山市南海区第六人民医院妇科，广东 佛山　528200；

2.南方医科大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州　510282)



卵巢癌组织中microRNA-7表达水平及其临床意义

焦丽敏1，梁进1，王琼1，李纪强2

(1. 佛山市南海区第六人民医院妇科，广东 佛山528200；

2.南方医科大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州510282)

摘要：目的探讨microRNA-7在卵巢癌组织中的表达水平及其临床意义。方法收集该院确诊的卵巢癌患者42例，每例均行手术切除。同时收集38例良性卵巢上皮囊肿组织作为良性对照组。采用RT-PCR方法分别检测卵巢癌组织、癌旁组织和良性病变组织样本microRNA-7的表达，并分析其表达与卵巢癌临床特征的关系。结果卵巢癌组织microRNA-7表达为0.176±0.063，癌旁组织表达为0.314±0.099，良性病变组织表达为0.465±0.123。与癌旁组织和良性病变组织比较，卵巢癌组织中microRNA-7 表达显著下降(P均<0.05)。microRNA-7的表达与患者的年龄、病理分型无关，与临床分期和区域淋巴结转移相关(P均<0.05)。单因素分析结果显示，microRNA-7高表达的卵巢癌病人总生存期长于低表达组(P=0.02)。结论 microRNA-7在卵巢癌组织中表达下显著调，可能是卵巢癌患者重要的预后指标之一。

关键词：卵巢癌；微小RNA；microRNA-7；RT-PCR

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，据最新统计，在全球范围内，卵巢癌在妇科肿瘤中发病率居于第3位，而死亡率居于第1位[1]。卵巢癌对于放、化疗敏感性较差，且能够进行根治性手术治疗的患者比例较低，因此卵巢癌患者总体预后不良[2]。在目前治疗方法尚未取得突破性进展以前，寻找评估卵巢癌预后的可能指标对于提高卵巢癌治疗效果具有重要意义。

研究发现，microRNA在恶性肿瘤的诊断和预后评估中发挥越来越重要的作用，microRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，通过与mRNA完全或不完全配对，通过降解mRNA或阻遏其转录后翻译的调节机制，发挥其独特的负调控基因表达的能力。microRNA-7是一种具有抑癌作用的microRNA，在结直肠癌、乳腺癌和肺癌等肿瘤组织中显著低表达，具有良好的评估诊断和预后的作用[3-5]。但在卵巢癌组织中尚未见文献报道，本文拟检测卵巢癌组织、癌旁组织和良性病变组织中microRNA-7的表达，并探讨其与卵巢癌临床特征之间的关系。

1材料与方法

1.1标本来源收集本院妇科2011年1月至2012年1月经过病理组织学确诊的42例卵巢癌患者的肿瘤标本和癌旁标本。在取得标本时，均未进行手术或放化疗，最终，所有纳入患者均经过术后病理学并影像学确认。收集本院2011年1月至2012年1月经过病理组织学确诊的38例卵巢上皮囊肿组织作为良性对照组。

1.2主要试剂与仪器RNA抽提试剂盒(Qiagen，GER)，RT-PCR反应试剂盒、dNTPMix、RNasin (TaKaRa公司)，microRNA-7的特异性茎环引物和探针(Ambion, USA)，U6B的特异性茎环引物和探针(Ambion，USA)。仪器：V 22000型紫外分光光度计(上海尤尼可仪器有限公司)，移液器(Eppendorf，GER)；低温高速离心机购自(Beckman, USA)，7900型定量PCR仪(ABI, USA)。

1.3实验方法

1.3.1组织标本总RNA提取按照RNA提取试剂盒说明书提取组织中的microRNA。RNA，紫外分光光度计测RNA浓度及纯度，取吸光值(A)比值为1.8～2.1的样品用于后续试验。

1.3.2qRT-PCR检测microRNA-7 表达采用SYBR green法检测microRNA-7的表达水平，选用U6snRNA作为内参。定量PCR仪进行qRT-PCR，将所有cDNA样品分别配置qRT-PCR反应体系，体系配置如下：逆转录产物2 μL，10×PCR缓冲液1 μL，PCR特异引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)1 μL，MgCl2溶液0.6 μL，0.5 U Taq聚合酶0.2 μL，2 ×ROX Reference Dye 0．2 μL，加水至总体积为8 μL。反应条件：95 ℃ 3 min活化Taq聚合酶；40个PCR循环(95℃ 15 s；60 ℃ 20 s；72℃ 20 s；78℃ 20 s)。扩增反应结束后，并从60℃缓慢加热到99℃。采用Primer 5．0软件设计microRNA特异性引物。采用2-△Ct法计算组织中microRNA-7水平。△Ct=Ct(microRNA-7)-Ct(U6)，每个样本设立3个平行管。

1.4生存期随访随访截止于2015年1月1日，采用电话随访，随访率为92.86%。总生存期从确诊日期至死亡或随访截止日期。

1.5统计方法应用SPSS14.0对实验数据进行统计学处理。计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，生存期分析采用Kaplan-Meier法，两组生存比较为Logrank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1microRNA-7分别在卵巢癌组织、癌旁组织和良性病变组织样本中表达情况卵巢癌组织microRNA-7表达为0.176±0.063，癌旁组织表达为0.314±0.099，良性病变组织表达为0.465±0.123。与癌旁组织和良性病变组织比较，卵巢癌组织中microRNA-7 表达显著下降(P均<0.05)。

2.2卵巢癌组织中microRNA-7表达水平和临床病理特征之间的关系microRNA-7在卵巢癌患者组织中的表达与年龄和病理类型无关，与临床分期、分化程度及淋巴结转移有关。临床分期为Ⅲ级、Ⅳ级的患者，microRNA-7表达水平较低；低分化程度或(和)淋巴结转移的microRNA-7水平降低，差异均有统计学意义(P<0．05)。见图1。

2.3卵巢癌患者组织microRNA-7表达水平和生存期之间的关系截止至随访时间，42例患者中有25例存活，全组中位总生存时间为29.9个月。microRNA-7高表达组中位总生存时间为40.5个月，明显高于microRNA-7低表达组的22.7个月(LOGRANK检验P=0.02)，见图2。

3讨论

目前临床中应用的卵巢癌肿瘤标志物主要包括糖类抗原125(cancer antigen 125, CA125)和人附睾蛋白4(human epididymis secretory protein 4, HE4)，二者对于卵巢癌的诊断有一定价值，但对于预测卵巢癌复发及预后存在明显局限性。进一步寻找能够有效帮助卵巢癌诊断和预后判定的肿瘤标志物具有重要意义。通过研究肿瘤组织中microRNA表达情况，从而帮助肿瘤的诊断和预后判定在很多肿瘤中已有研究。在前期研究的基础上，我们发现microRNA-7可能同卵巢癌密切相关。microRNA-7是一个定位在人类基因组3个不同基因位点的内含子miRNA，保守存在于在所有物种之中。研究发现在多种常见恶性肿瘤中miR-7均表达异常，其在恶性转化和转移中起着重要的作用。本研究发现：卵巢癌组织中microRNA-7表达显著下降，并且同卵巢癌较晚临床分期和转移等不良预后因素密切相关。这一研究同既往microRNA-7在其他肿瘤病灶中表达相关研究一致，比如microRNA-7在人类乳腺癌、结直肠癌、肺癌等多种肿瘤组织中显著低表达：有研究采用Real-time PCR技术检测多种结直肠癌细胞系microRNA-7的表达，发现所有的细胞系的microRNA-7表达均明显下调，同时发现结直肠癌组织中microRNA-7表达较癌旁组织显著下调[6]。在乳腺癌组织中microRNA-7的表达较正常乳腺组织显著下降，并且microRNA-7的表达水平同乳腺癌转移呈负相关[4]。非小细胞肺癌细胞系A549和 H1299中的microRNA-7表达显著下调；同时与癌旁组织相比，非小细胞肺癌组织中的microRNA-7表达同样下调[7]。

图1　卵巢癌患者组织microRN-7表达和临床病理特征的关系(*P<0．05)

图2　microRNA-7高表达和低表达组病人的生存曲线

microRNA在生物体内广泛存在，在调节细胞增殖、凋亡、分化等重要过程中均发挥重要作用[6,8]，且在物种之间具有高度保守性[9]。基于上述特征，其在恶性肿瘤的发生、发展过程中，起到重要作用。有的发挥原癌基因的作用，有的起到抑癌基因的作用。然而microRNA主要参与转录后基因表达调控，即是通过不完全互补结合到目标靶mRNA 3’非编码区端，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成，阻断mRNA的翻译，发挥其独特的负调控基因表达的能力。microRNA-7通过何种途径参与卵巢癌发生、发展，至今尚未有明确结论。然而，在其他肿瘤中已经有研究进行了初步的探讨。有研究采用生物信息学在乳腺癌组织中分析预测microRNA-7的靶基因，共有114个靶基因被预测出[4]，进一步对这些靶基因进行功能学分析发现，这些靶基因的功能与肿瘤细胞的生长、转移等密切相关。值得注意的是，microRNA-7对肿瘤细胞的生物学效应是通过作用于细胞内多个靶点甚至整个信号调节网络产生的。在研究开始过程中仅研究一个或数个靶点，但在分析其在细胞的生物学行为方面的作用时应综合考虑。

本研究初步发现microRNA-7可以有助于卵巢癌患者预后的判断，microRNA-7在卵巢癌组织中高表达患者的生存期长于低表达者。目前在包括卵巢癌在内的多种肿瘤组织中检测的许多microRNA均有类似结论，比如在细胞水平microRNA-129-5p可以抑制卵巢癌细胞的生长和存活时间，起到抑癌作用[10]，microRNA-126在体内具有抑制结肠癌细胞增殖及侵袭转移，microRNA-19则可以促进非小细胞肺癌的转移，且可能是化疗药物的作用靶点。在临床研究中，Delfino等对272例卵巢癌患者的799个microRNA进行检测，进而分析其与卵巢癌患者生存期和复发的关系，发现3个microRNA(hsa-miR-16, hsa-miR-22*, and ebv-miR-BHRF1-2)同卵巢癌复发和生存期显著相关[11]。microRNA-7的功能学认识目前被基本认为一个抑癌基因：既可以通过直接作用于重要靶基因而影响细胞黏附、迁移、侵袭、远处转移以及上皮间质转化等重要生物学过程，进而影响肿瘤的进展；又可以通过促进肿瘤对药物治疗的敏感性、抑制肿瘤血管生成等方面间接发挥抑癌作用。但microRNA-7在卵巢癌中的研究尚少见到[12-16]。本研究因为研究设计问题未能进行复发情况分析。同时由于研究时间所限，本研究纳入的例数较少，可能需要进一步扩大样本量进行分析。

综上所述，卵巢癌病人组织中microRNA-7表达水平显著下降，且其下降与不良临床特征有关，且在卵巢癌预后评估中有一定的价值，可用于辅助卵巢癌的预后评估。

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Expression and clinical significance of microRNA-7 in tissue of ovarian cancer patients

JIAO Li-min,LIANG Jin,WANG Qiong,et al

(DepartmentofGynecology,The6thPeople’sHospitalofFoshan，NanhaiDistrict,Foshan,

Guangdong528200,China)

Abstract：ObjectiveTo explore the expression of microRNA-7 in tissue of ovarian cancer patients and to analyze the relationship between microRNA-7 and clinical features. Methods We enrolled 42 ovarian cancer patients and 38 controls with benign ovarian epithelial cyst in the study. By the reverse transcription-real time polymerase chain reaction (RT-qPCR), the expression of microRNA-7 was detected in tumor tissues, paracancerous tissues and benign tissues. Results Compared with the controls, microRNA-7 in the tissues of ovarian cancer patients was significantly reduced (P<0.05). The expression of microRNA-7 in the tissues of ovarian cancer patients was not related to the age or pathological type, but to the clinical stage and metastasis (P<0.05). The patients with high microRNA-7 expression had better overall survival than the patients with low microRNA expression. Conclusion The expression of microRNA-7 in tissues of ovarian cancer patients is down regulated, which may become an important prognostic indicator for ovarian carcinoma.

Key words：ovarian carcinoma;microRNA;microRNA-7;RT-PCR

(收稿日期：2015-09-17，修回日期：2015-11-03)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.025

通信作者：李纪强，男，副主任医师，研究方向：microRNA在恶性肿瘤生长及转移中的作用，E-mail:banlangen12@163.com

基金项目：国家自然科学基金(No 81503526)