高压氧治疗对于急性脑梗死患者外周血单核细胞Toll样受体4的表达及预后的影响

雷　蕾，周志斌，姜　丹，彭　军

(武汉科技大学附属天佑医院神经内科，湖北 武汉　430064)



高压氧治疗对于急性脑梗死患者外周血单核细胞Toll样受体4的表达及预后的影响

雷蕾，周志斌，姜丹，彭军

(武汉科技大学附属天佑医院神经内科，湖北 武汉430064)

摘要：目的观察高压氧治疗对于急性脑梗死患者外周血单核细胞(PBMCs) Toll样受体4 (TLR-4)mRNA的表达及神经功能康复的影响。方法入选58例脑梗死患者，随机分为对照组和高压氧治疗组，两组患者均予常规药物治疗，高压氧治疗组在常规治疗基础上予以高压氧治疗。另入选25例健康体检者为健康对照组(正常组)，高压氧治疗前、治疗第5、10天分离两组患者PBMCs，荧光定量RT-PCR法检测TLR-4mRNA表达。高压氧治疗前、治疗第5、10天及起病21 d患者随访进行美国国立卫生院神经功能缺损评分(NIHSS)及日常生活能力(ADL)评分。结果脑梗死患者(对照组，高压氧治疗组)起病时外周血单核细胞TLR-4mRNA的表达均显著高于正常组，治疗后两组患者外周血TLR-4mRNA表达均下降，高压氧治疗组显著低于对照组。高压氧治疗组治疗第10天及起病21 d后NIHSS评分均显著低于对照组，ADL评分则高于对照组。结论高压氧治疗显著降低急性脑梗死患者外周血TLR-4mRNA的表达，减轻脑损伤后继发性炎症反应，促进神经功能的恢复，改善预后。

关键词:高压氧；脑梗死；Toll样受体4；神经功能预后

Toll样受体(Toll-like receptor ,TLR)是天然免疫中重要的病原体识别受体，可介导炎性因子的释放和免疫细胞激活，进而诱导获得免疫[1]。作为TLR家族成员之一，TLR-4信号转导通路在脑梗死等非病原微生物性炎症损伤过程中发挥着十分重要的作用,其参与介导脑缺血炎性损伤，促进脑缺血再灌注损害，而TLR-4基因缺失时则表现出对脑组织的保护作用[2]。高压氧(hyperbaric oxygen，HBO)治疗则可有效减轻脑缺血再灌注损伤的炎症反应，减少神经细胞的继发性死亡[3-4]。本研究通过观察急性脑梗死患者HBO治疗前后外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)TLR-4mRNA的表达及神经功能康复情况，进一步探讨其在神经保护机制中的作用，为临床治疗提供依据。

1资料与方法

1.1研究对象选择自2014年1月至2014年12月本院神经内科住院的诊断为急性脑梗死的患者58例,男35例,女23例,年龄(62.7±12.9)岁。均为初次发病,入院时间在起病72 h以内。所有病例均符合1995 年全国第4 届脑血管病学术会议修订的脑梗死标准[5],均经头颅计算机体层扫描(computerized tomography,CT)或磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI) 检查确诊。患者均经详细的神经系统体检及常规实验室检查(心电图、胸片、肝肾功能、凝血功能、血常规等)。排除标准:明显的肝肾功能障碍,感染或恶性疾病患者，肺大泡、气胸、慢性阻塞性肺病患者，血压超过180/110 mmHg的患者。将患者随机分为对照组和高压氧治疗组(随机数字表法)。本研究经过武汉科技大学附属天佑医院伦理委员会批准，所有患者均充分告知知情同意，并签署知情同意书。两组患者年龄、性别、吸烟、饮酒、血压、血脂等危险因素以及神经功能评分、日常生活能力评分方面差异均无统计学意义(表1)，另取25名健康体检者为健康对照组。

1.2研究方法两组患者均根据中国急性缺血性卒中诊治指南2010[6]推荐行常规抗血小板聚集、脑保护、调脂、调控血压对症治疗，高压氧治疗组在常规治疗基础上，入院后24 h内予高压氧治疗。采用GY3200型多人氧舱，治疗方案：加压舱压力取 0.1 MPa，采用间断吸氧，阶段性吸氧20 min×3，吸氧过程中休息5 min×2，连续治疗10次为1个疗程。高压氧治疗前、治疗第5天，10 d分离其PBMCs，荧光定量RT-PCR法检测TLR-4mRNA表达。治疗前、治疗第5天，10天及起病21 d对患者随访进行美国国立卫生院神经功能缺损评分(the National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)，采用Barthel指数(Barthel Index，BI)评分进行日常生活能力(activities ofdaily living，ADL)评定。

1.3人外周血单核细胞的分离取清晨空腹外周静脉血10 mL，肝素抗凝，以Ficoll密度梯度离心法分离外周血单核细胞。PBS(pH7.4)洗涤细胞2次，台盼蓝排斥实验示细胞存活率为98%，入Trizol中混匀，与血浆标本分别置入-70℃冰箱保存备用。

1.4荧光定量RT-PCR Trizol法提取各组细胞总RNA。行实时定量PCR扩增,以β-actin为内参，反应体系为: cDNA 1 μL、2× SYBR Green PCR Master mix12.5 μL、上下游引物各100 nm、ddH2O 灭补足至25 μL。扩增的反应条件: 95℃5 min, 94℃ 20 s,56℃ 20 s, 72℃ 20 s, 72℃ 5 min,55℃ 10 s,40个循环。循环结束后进行融点曲线分析，于60～95℃之间进行测定，(升温幅度：0.5℃/次，5秒/次)。引物序列如下TLR-4：上游5’-acatcaaatgcccctactca-3’，下游5’-ctaaaccagccagaccttga-3’; β-actin：上游5’-cattaaggagaagctgtgct-3’,下游5’-gttgaaggtagtttcgtgga-3’。反应结束后，根据Ct值通过公式2-ΔΔCt分析计算各目的基因相对表达量。

2结果

2.1各组患者基线临床资料比较实验组与对照组两组患者年龄、性别构成、吸烟、高血压、糖尿病、高脂血症等危险因素以及NIHSS评分、ADL评分方面差异均无统计学意义；与正常组比较，年龄、性别构成差异无无统计学意义(表1)。

表1　各组患者一般临床资料比较

注：高血压：指需要治疗的高血压患者；糖尿病：需要治疗(包括饮食控制)的胰岛素依赖和非胰岛素依赖的糖尿病患者。高脂血症：根据本院实验室诊断标准诊断胆固醇或甘油三酯水平增高的患者。

2.2高压氧治疗对于患者外周血单核细胞TLR-4mRNA的表达的影响高压氧治疗前(0 d)，急性脑梗死患者(高压氧组，对照组)外周血单核细胞TLR-4mRNA显著高于正常组，高压氧组第5天外周血单核细胞TLR-4mRNA较0 d下降。高压氧治疗第10天，高压氧组，对照组外周血单核细胞TLR-4mRNA均较0 d下降，高压氧治疗组下降至基线水平(正常组)，显著低于对照组(图1)。

2.3各组患者治疗前后NIHSS、ADL评分高压氧治疗组患者在高压氧治疗10 d及起病21 d后NIHSS评分及ADL评分均优于对照组，并且随着治疗时间延长，改善愈明显。但在治疗第5天两组差异无统计学意义。见表2。

图1　各组患者外周血单核细胞TLR-4mRNA的表达

注：与健康对照组相比,*P<0.01，同时间与对照组相比,△P<0.01,与第5天对照组相比,§P<0.01。

表2　高压氧组与对照组治疗前后NIHSS、ADL评分比较

3讨论

脑缺血再灌注导致的炎性反应参与了脑损伤过程[7]，炎症免疫反应是脑缺血再灌注损伤的重要机制。过度炎症免疫是包括脑梗死在内的多脏器缺血再灌注损伤等病理情况的共同标志，而TLR-4在病原菌介导的炎症及非感染性炎症中均起着重要的作用。TLR-4在中枢神经主要表达在小胶质细胞，在中枢神经系统损伤中发挥关键作用， 损伤介质主要来源于小胶质细胞。脑组织发生缺血后，缺血血管、受损脑细胞以及细胞外基质可以释放一些蛋白分子，如释放热休克蛋白、透明质酸、防御素和弹性蛋白酶，这些内源性激活物作为内源性配体与 TLR4受体相互结合，通过MAPK/NF-κB和NF-κB/IRF3等信号转导途径，启动免疫反应，诱导产生TNF-α、IL-6、IL-113等多种炎性因子、趋化因子等"级联式"释放，产生炎症反应，参与介导并加重脑缺血炎性损伤[8-9]。

脑缺血动物实验研究表明，TLR-4缺陷小鼠脑缺血再灌注后的梗死体积较野生型小鼠显着缩小。TLR-4基因小鼠的脑缺血后炎性反应和脑损害有所减轻。Caso等[10]通过建立小鼠大脑中动脉栓塞动物模型，研究发现，与对照组相比(野生小鼠)，TLR-4基因敲除小鼠脑梗死体积较小，炎症反应较轻，血清TNF-α和IL-6、干扰素调节因子1等炎性因子明显降低，神经功能及行为功能恢复结果较好，推论其发生的机制可能是由于TLR-4缺陷，导致其介导的炎性信号通路被阻断或抑制，降低了免疫反应和组织损害程度。Brea等[11]应用流式细胞仪检测脑梗死急性期患者外周血单核细胞TLR-4的表达，发现其与患者预后独立相关，预后较差的患者TLR-4的表达显著增高，同时其血清TNF-α、IL-1β、IL-6、 VCAM-1等炎性因子表达水平同步显著增高，TLR-4表达与TNF-α、IL-1β、IL-6、 VCAM-1水平呈正相关。TLR-4表达与脑梗死体积独立正相关。本研究亦表明急性脑梗死患者急性期外周血单核细胞TLR-4mRNA表达较健康对照组显著增高。TLR-4mRNA增高的机制可能是脑梗死时脑组织缺血缺氧，导致血管内皮通透性增高及坏死物质释放，TLR-4启动免疫反应，通过其信号通路引起TNF-α等炎性因子分泌增多，参与介导脑缺血炎性损伤。同时可吸引富含TLR-4表达的外源性的单核巨噬细胞、淋巴细胞等炎性趋化聚集，成为加剧炎性损伤的效应细胞。

大量动物实验及临床观察表明高压氧治疗在脑梗死患者神经功能恢复方面发挥着积极作用，是治疗缺血性脑血管病的一种有潜力的物理疗法。但其作用机制尚未明确。其脑保护机制大致有如下几点[12-13]：(1)提高血氧分压与血氧含量，改善微循环，改善代谢，增加组织内氧的弥散，迅速改善病灶供氧及代谢，减少酸性代谢物质；(2)维护血脑屏障的完整性，降低血脑屏障通透性减少血液中水分向组织渗透，减轻组织水肿，降低颅内压；(3)抑制兴奋性氨基酸毒性作用，及抑制海马一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS) mRNA 的表达，抑制神经元凋亡；(4)清除脑组织自由基，加强组织抗氧化能力，减轻脑缺血再灌注损伤的炎症反应；(5)降低血液黏滞度，减轻血小板的聚集，有利于缺氧脑区血液循环的恢复。

本研究表明，虽然在高压氧治疗第5天，高压氧治疗组与对照组两组NIHSS评分及ADL评分无统计学差异，但在高压氧治疗第10天及起病21 d后，高压氧治疗组患者NIHSS评分及ADL评分均优于对照组，并且随着治疗时间延长，改善愈明显。表明高压氧治疗可有效改善患者远期预后。同时高压氧治疗组显著抑制患者外周血单核细胞TLR-4mRNA表达的增高，治疗10 d时基本恢复至基线水平。徐江等[14]研究表明高压氧治疗可显著抑制脑缺血再灌注大鼠脑组织NF-κB 的活性和 ICAM-1 的表达的增高，减少脑梗死的体积。本研究表明高压氧治疗可抑制脑梗死患者外周血TLR-4的表达，而TLR-4位于NF-κB等炎性信号传导途径的上游，这可能是其高压氧治疗减轻脑缺血再灌注损伤的炎症反应机制之一。

总之，本研究表明高压氧治疗可通过抑制TLR-4的表达，减轻脑损伤后继发性炎症反应，促进缺血性脑血管病患者神经功能的恢复，改善预后。

参考文献：

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Effects of hyperbaric oxygen on the rehabilitation of nervous function and expression of Toll-like receptor4 mRNA on peripheral blood mononuclear cells in patients with acute cerebral infarction

LEI Lei, ZHOU Zhi-bin, JIANG Dan, et al

(DepartmentofNeurology,TianyouHospitalAffiliatedtoWuhanUniversityofTechnology,Wuhan,Hubei430064,China)

Abstract:Objective To investigate the effects of hyperbaric oxygen(HBO) on the rehabilitation of nervous function and expression of Toll-like receptor4(TLR-4)mRNA on peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in serum in patients with acute cerebral infarction.Methods The 58 patients with acute cerebral infarction were randomized into control group and HBO group. All patients were undergoing conventional medical treatment, and HBO group also received HBO therapy. In addition, 25 health controls were included. The expression of TLR-4 mRNA on PBMCs from 80 patients were measured by real time quantitative RT-PCR before and on the 5th ,10th day of HBO treatment. The National Institutes of Health stroke scale(NIHSS) and the Barthel index(BI) were also used for evaluation before and on the 5th，10th day of HBO treatment，and 21st day after onset.ResultsThe expression of TLR-4 on PBMCs in patients with acute cerebral infarction was significantly increased compared to health controls (P< 0.01) on the onset. After treatment, it declined, and HBO group was significantly lower than control group.On the 10th day of treatment，and 21st day after onset，in HBO group，NIHSS scores were significantly lower while BI scores were significantly higher than control group(P< 0.01) . Conclusions The expression of TLR-4 mRNA on PBMCs of acute cerebral patients can be significantly depressed by HBO therapy, which decreases inflammatory reaction secondary to cerebral injury, promotes rehabilitation of nervous function and improves the outcome.

Key words:hyperbaric oxygen；cerebral infarction；Toll-like receptor4；nervous function；outcome

(收稿日期：2015-08-17，修回日期：2015-11-21)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.026