分光光度法在食品蛋白质中二硫键含量测定中的应用

◎ 平秋婷

（广东省生物工程研究所（广州甘蔗糖业研究所），广东 广州 510000）

蛋白质是一种非常重要的生物大分子，其能够存在于一切生物体内中，是细胞最主要的一种成分，同时也是生命体的基础构成物质，属于天然的表面活性剂和营养物质[1]。但蛋白质的结构却非常容易因二硫键而受到影响，并且蛋白质的结构还可能致使蛋白质的表面活性因此发生改变[2]。鉴于此，本研究用分光光度法对食品蛋白质的二硫键含量进行测定，旨在进一步了解蛋白质的性能和结构关系，尤其是蛋白质结构与活性性能之间的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

从市面上购入新鲜豆浆。所需试剂有尿素、十二烷基硫酸钠、EDTA、无水亚硫酸钠、浓盐酸和三氨基甲烷等。所需仪器有pH计（METTLER TOLEDO，Seven Easy）、紫外可见光光度计（岛津，UV-2550）。

1.2 方法

1.2.1 制备NTSB

取1 mol/L亚硫酸钠溶液10 mL与100 mg Ellment试剂充分混合，在38 ℃条件下通入氧气直至颜色从亮红色转变为淡黄色，即表示完成NTSB试剂制备。

1.2.2 豆浆中二硫键含量测定

①取豆浆置于试管中，将试管口堵上，对其进行热处理。向试管内加入20 mL豆浆，将塞子拧紧，将其放置在95 ℃条件下进行水浴处理，持续90 min，对其连续进行3次重复处理。②各取2 mL（1号）与4 mL（2号）样品，并向其中分别加入18 mL与16 mL丙酮，充分摇匀，放置10 min，再行15 min离心处理，再加入丙酮10 mL行悬浮沉淀处理，再进行15 min的离心处理，重复2次。③取20 mL缓冲液（尿毒8 mol/L，1%SDS，EDTA 3 mmol/L，0.2 mol/L Tris-HC1，0.1 mol/L Na2SO3）加入到1号处理后豆浆中，另取20 mL缓 冲 液（ 尿 毒 8 mol/L，1%SDS，EDTA 3 mmol/L，0.2 mol/L Tris-HC1）加入到2号处理后豆浆中。对其进行充分的振荡处理，使其能够完全溶解混合。④分别取 0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL和 1.50 mL的 1号溶液置于试管中，再对各试管分别进行3次测试取平均值，取缓冲液（尿毒8 mol/L，1%SDS，EDTA 3 mmol/L，0.2 mol/L Tris-HC1，0.1 mol/L Na2SO3，10 mmol/L 5，5'-二硫代-2-硝基苯甲酸）相同剂量，加入到试管中，再取缓冲液（尿毒8 mol/L，1%SDS，EDTA 3 mmol/L，0.2 mol/L Tris-HC1，0.1 mol/L Na2SO3） 将 其 稀 释 到3 mL，即可行吸光度测定。⑤分别取0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL和1.50 mL的1号溶液置于试管中，再对各试管分别进行3次测试取平均值，取缓冲液（0.2 mol/L Tris-HC1，10 mmol/L 5，5'-二硫代-2-硝基苯甲酸）0.1 mL加入中，对其进行30 min的振荡处理，再次向其中加入缓冲液（尿毒8 mol/L，1%SDS，EDTA 3 mmol/L，0.2 mol/L Tris-HC1）将其稀释到3 mL，即可行吸光度测定。

1.2.3 巯基和二硫键含量计算公式

当pH值达到8时，N TB的摩尔消光系数为13 600 mol/L·cm。

其中，A412nm指吸光度；D用于表示稀释倍数×20；C表示豆浆固形物的含量；V表示牛奶或豆浆的体积[3]。

2 结果与分析

通过对豆浆进行90 min热处理，经分光光度法测定结果显示，所取得的样品体积与游离巯基的吸光度表现为较好的线性关系，并且线性回归之后即可获得线性方程式：y=0.168 2x，r2=0.996（见图1）。

图1 豆浆热处理90min后游离巯基图

取得的样品体积与总巯基含量的吸光度表现为正比，并且线性回归之后即可获得线性方程式：y=0.288 8x，r2=0.998（见图2）。通过豆浆样品测试，其含有的二硫键含量为8.886 μmol/g。

图2 豆浆热处理90min后总巯基图

3 结论

通过对豆浆样品中蛋白质二硫键含量进行测定，结果证实，分光光度法所获得的巯基含量与吸光度均表现为较好的线性关系，这表明分光光度法用于食品蛋白质二硫键含量测定的方法具有可操作性和实用性[4]，能够用于了解蛋白质性能与结构的关系。

参考文献：

[1]王 芳，包怡红，于 震.食品中蛋白质快速检测技术的研究[J].食品工业科技，2014，35（11）：372-375.

[2]何保山，王 丹，左春艳，等.用分光光度法快速测定蛋白质含量的研究[J].河南工业大学学报（自然科学版），2011，31（4）：27-29，35.

[3]梁琴琴，李永生.流动注射分光光度法快速测定乳制品中的蛋白质含量[J].分析化学，2011，39（9）：1412-1417.

[4]房列涛，兰 雪，沈秀军，等.双波长600nm/460nm分光光度法测定蛋白质含量研究[J].生物学杂志，2015，32（4）：94-97.