结直肠癌患者肿瘤组织及血清ADAM10的表达

郑佳，盛显仓（台州市第一人民医院　消化内科，浙江　台州　318020）



结直肠癌患者肿瘤组织及血清ADAM10的表达

郑佳，盛显仓
（台州市第一人民医院消化内科，浙江台州318020）

[摘 要]目的：检测结直肠癌患者肿瘤组织和血清中解离素金属蛋白酶10（ADAM10）的表达，分析其与结直肠癌发生、发展及临床病理特征间的联系。方法：应用免疫组织化学SP法检测59例结直肠癌组织、30例结直肠息肉组织及30例正常对照人群肠黏膜中的ADAM10的表达情况，采用双抗体夹心ELISA方法检测上述3组人群血清中的ADAM10表达水平。结果：结直肠癌患者组织和血清中ADAM10的表达水平显著高于结直肠息肉组和正常对照人群（P＜0.001）；伴随着肿瘤Duke分期的增加，结直肠癌患者组织和血清中ADAM10表达水平进行性升高。癌组织和血清中的ADAM10表达水平和结直肠癌患者的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、组织类型无关（P＞0.05），而与肿瘤的分化程度、淋巴结转移、肿瘤远处转移、Duke分期有关（P＜0.01）。

结论：ADAM10在结直肠癌患者癌组织和血清中高表达，且和结直肠癌的重要临床病理特征相关，在结直肠癌的诊断中具有一定的临床应用价值。

[关键词]结直肠肿瘤；病理分析；解离素金属蛋白酶10

结直肠癌是最常见的消化系统恶性肿瘤，其发生和个人遗传、饮食、环境等诸多因素有关。在我国随着生活习惯的改变，发病率日益增高。解离素金属蛋白酶10（adisintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）是一种跨膜金属蛋白，通过调节Notch[1]、上皮细胞型钙黏蛋白、表皮生长因子、表皮生长因子受体2和炎性细胞因子等，参与肿瘤的形成，促进肿瘤的侵袭和转移[2]。大量研究表明，ADAM10在肝癌、前列腺癌[3]、黑色素瘤[4]、结肠癌[5]和口腔鳞状上皮细胞癌[6]等多种肿瘤中过表达，并在肿瘤的形成过程中起重要作用[7]。本研究通过检测ADAM10在结直肠癌患者肿瘤组织和血清中的表达情况，探讨其和临床病理特征的关系，为进一步研究结直肠癌的发病机制、肿瘤治疗、推测预后提供依据。

1　资料和方法

1.1 一般资料 收集结直肠癌患者59例，其中男39例，女20例，年龄38～89岁，平均（63.3±12.8）岁，所有患者术前均未行放化疗，病理结果证实为结直肠癌。结直肠息肉患者30例，其中男18例，女12例，年龄25～79岁，平均（47.2±13.7）岁，病理结果证实为结直肠腺瘤性息肉。正常对照人群30例，其中男17例，女13例，年龄21～66岁，平均（41.2±10.4）岁，肠镜检查阴性，各项生化指标均正常。研究对象为2012年6月-2014年6月在台州市第一人民医院就诊的门诊、住院患者和健康体检者。

1.2方法

1.2.1样本采集：①组织采集：肠镜检查时采取新鲜的结直肠癌组织、肠息肉组织、正常肠黏膜组织，用4%甲醛溶液固定后保存待测；②血清采集：采用EDTA真空采血管分别抽取结直肠癌、结直肠息肉患者和正常健康对照者的静脉血4 mL，以4 000 r/min离心15 min后分离血清，于-80 ℃保存待测。

1.2.2实验方法：①免疫组织化学SP法检测癌组织、结直肠息肉组织、正常肠黏膜组织中的ADAM10表达，组织标本进行石蜡包埋、切片、脱蜡、水化、枸橼酸盐抗原修复液高压抗原修复；3%过氧化氢37 ℃温箱孵育10 min，消除内源性过氧化物酶活性，滴加正常山羊血清37 ℃孵育10 min，滴加1:100的兔抗人ADAM10多克隆抗体，4 ℃冰箱过夜，滴加生物素标记的羊抗兔二抗，37 ℃湿盒孵育30 min，二氨基联苯胺（3，3-diaminobenzidine，DAB）显色剂显色，自来水冲洗，苏木素复染，1%盐酸酒精酚化，脱水干燥，中性树胶封片。以试剂盒中阳性切片作为染色的阳性对照，磷酸盐缓冲液替代一抗为染色的阴性对照。②ELISA法检测结直肠癌、结直肠息肉患者和正常健康对照者的血清ADAM10的表达水平，操作步骤按照试剂盒说明书进行。根据正常人群测定结果确定临界值范围（说明书提供），ADAM10 ＜150 pg/mL。ELISA试剂盒、兔抗人ADAM10多克隆抗体均购自上海晶美生物科技有限公司。

1.2.3结果判断：ADAM10定位于细胞浆和胞膜，呈棕黄色细颗粒状，胞核不染色，每张切片随机选取3个高倍镜视野，以阳性细胞比例的平均值定义为该肿瘤的阳性细胞百分比。细胞不着色为“-”；阳性细胞数＜25%为“+’’；阳性细胞数25%～75%为“++”；阳性细胞数＞75%为“+++”。以细胞浆或细胞膜出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性，染色的强弱以0～3表示，染色范围以0～100表示，通过染色强度和染色范围相乘得到染色积分（0～300），染色积分＞中位数为高表达。免疫组织化学结果由2位病理科医师分别采取双盲阅片判定。

1.3统计学处理方法 采用SPSS13.0软件进行统计学分析，用Excel制作统计图，计量资料用±s表示，组间率的比较采用x2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1结直肠癌患者血清中ADAM10的表达 结直肠癌患者组ADAM10血清平均浓度为（347.4±32.2）pg/ mL，显著高于结直肠息肉组（178.3±14.2）pg/mL和正常对照人群（82.6±10.6）pg/mL（P＜0.01），见图1。结直肠癌患者Duke A、B、C、D期患者血清ADAM10水平分别为（195.4±18.6）pg/mL、（267.1± 27.8）pg/mL、（322.9±29.5）pg/mL、（390.6± 30.8）pg/mL。伴随着肿瘤Duke分期的增加，结直肠癌患者血清ADAM10水平进行性升高，Duke分期A、B、C、D 4期比较差异具有统计学意义（P＜0.01），见图2。

图1　结直肠癌、结直肠息肉、正常对照人群血清ADAM10水平

图2　结直肠癌Duke A、B、C、D 4期血清ADAM10水平

2.2结直肠癌患者组织中ADAM10的表达 ADAM10主要表达于细胞胞浆和胞膜，细胞间质不染色，见图3a。ADAM10在结直肠癌中表达阳性率为77.97%，在结直肠息肉组织中及正常肠黏膜组织中表达阳性率分别为10%和6.6%，结直肠癌组织中的ADAM10的阳性率显著高于结直肠息肉组和正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。伴随着结直肠癌患者肿瘤分期的增加，结直肠癌患者肿瘤组织中ADAM10表达阳性率也进行性上升，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

2.3血清及肿瘤组织中ADAM10表达与临床病理特征的关系 结直肠癌患者血清及肿瘤组织中的ADAM10表达与结直肠癌患者的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、组织类型无相关性（P＞0.05）；而与肿瘤的分化程度、淋巴结转移、肿瘤远处转移、Duke分期有相关性（P＜0.01）。见表1。

图3　ADAM10在结直肠癌及正常肠黏膜中的表达（SP法，×400）

表1　结直肠癌患者血清ADAM10水平及肿瘤组织中ADAM10的表达与临床病理特征的关系

3　讨论

ADAM10具有独特的结构和生物功能，成为近年来研究的热点，其属于跨膜金属蛋白酶，具有4个功能区域：蛋白水解域、粘连域、融合域和胞内信号域，在很多恶性肿瘤中高度表达，和肿瘤细胞的复制、侵袭、浸润过程有紧密的联系[8-9]。研究证实ADAM10的过表达能促进口腔鳞状细胞癌[10]和胃癌的生长，同样发现通过干扰ADAM10使之表达下调可使肿瘤细胞减缓增殖，所以ADAM10被认为是肿瘤治疗的新的潜在靶点[6，11]。

本研究发现，结直肠癌患者的血清ADAM10表达水平显著高于结直肠息肉组和正常对照人群。伴随着肿瘤Duke分期的增加，结直肠癌患者血清ADAM10水平进行性升高，差异具有统计学意义。采用免疫组织化学方法检测结直肠癌组织、结直肠息肉组织及正常肠黏膜组织中的ADAM10的表达水平，结果显示，结直肠癌组织中的ADAM10表达阳性率显著高于结直肠息肉组和正常肠黏膜组，提示ADAM10可能参与了从正常-腺瘤-癌的整个结直肠癌的演变过程。免疫组织化学发现ADAM10表达主要在细胞浆和胞膜，细胞间质不染色，进一步证实了ADAM10是一种跨膜蛋白，ADAM10通过对跨膜蛋白的蛋白水解、释放胞外域的作用，并且还可和许多信号分子和黏附分子等相互作用，参与肿瘤的发生、发展、浸润的过程。由此，我们推测血清中的ADAM10表达水平和组织中的ADAM10表达水平密切相关，ADAM10表达水平越高，侵袭性越强。结直肠癌细胞通过大量表达ADAM10来水解细胞外基质来促进癌细胞的侵袭、浸润。Murai等[12]在人胶质母细胞瘤U251研究中表明，ADAM10能裂解黏附分子CD44，促进细胞的迁移和侵袭。Schulz等[13]证实ADAM10有水解细胞外胶质IV型胎盘胶原的作用，推测其可能参与癌细胞的侵袭和扩散。Fogel等[14]发现在卵巢癌和子宫癌中，ADAM10介导黏附分子L1释放，增强细胞迁移和肿瘤播散。Gavert等[5]研究表明ADAM10的过表达可以增强结直肠癌细胞的内源性L1-CAM的断裂和诱导肝转移，同时也可以提高恒定转染L1-CAM的结肠癌细胞转移能力。而本实验中我们发现结直肠癌患者血清ADAM10表达水平伴随着肿瘤分期的增加而进行性升高，进一步提示ADAM10在肿瘤的生长、浸润、转移过程中起到重要作用。结直肠癌患者血清及肿瘤组织中的ADAM10表达和结直肠癌患者的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、组织类型无关（P＞0.05），而与肿瘤的分化程度、淋巴结转移、肿瘤远处转移、Duke分期有关（P＜0.01），由此我们可以推测ADAM10的高表达和结直肠癌的预后密切相关，可以作为预后的指标。

本研究发现ADAM10在结直肠癌患者血清及组织中高表达，而在正常组织中极低表达，有潜力作为一种新的肿瘤标志物，如果能够以调控ADAM10的表达为目标，抑制肿瘤细胞的转移和侵袭，有希望为结直肠癌的靶向治疗提供新的思路。

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（本文编辑：吴彬）

·临 床 经 验·

·论著·

Study on the expression of ADAM10 in colorectal cancer tissues and serum

ZHENG Jia,SHENG Xiancang.
Department of Gastroenterology,Taizhou First People’s Hospital,Taizhou,318020

Abstract:Objective:To detect the expression of ADAM10 in colorectal cancer tissue and serum,analyze the relationship between colorectal cancer occurrence,development,and clinical pathological characteristics.Methods:Samples of 59 colorectal cancer tissues,30 colorectal polyps tissues and 30 health human of normal intestinal mucosa tissue were collected to detect the expressions of ADAM10 with immunohistochemistry SP.ADAM10 expression in serum of the above three groups was detected with double antibody sandwich ELISA method.Results:The expression level of ADAM10 in serum and tissue in the colorectal cancer patients was significantly higher than that in colorectal polyps groups and normal control groups (P＜0.001).ADAM10 expression levels were elevated in serum and tissue of the colorectal cancer patients with the increase of tumor Duke stage.The expression level of ADAM10 in serum and tissue of the colorectal cancer patients was no relationship with the sex,age,the location of the tumor,tumor size,histological type (P＞0.05),and was correlated with the tumor differentiation,lymphoid node diversion,distant metastasize,Duke stage (P＜0.01).Conclusion:Colorectal cancer patients has higher expression of ADAM10 in cancer tissue and serum,and related with clinical pathological characteristics of colorectal cancer.It has a certain clinical value in the diagnosis of colorectal cancer.

Key words:colorectal neoplasms; athological analysis; adisintegrin and metalloproteinase 10

作者简介：郑佳（1980-），女，浙江台州人，主治医师，硕士。

基金项目：台州市黄岩区科技计划项目（2011062-3）。

收稿日期：2015-04-22

[中图分类号]R735.3

[文献标志码]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.03.008