耐热普鲁兰酶CBM68结构域中关键位点对其酶学性质的影响

申莹莹，郑宏臣，李树芳，付晓平，徐健勇，宋诙*

1(天津科技大学 生物工程学院，天津， 300457)　2(中国科学院 天津工业生物技术研究所，工业酶国家工程实验室，天津， 300308)　3(中国科学院 天津工业生物技术研究所，天津工业生物系统与过程重点实验室，天津， 300308)



耐热普鲁兰酶CBM68结构域中关键位点对其酶学性质的影响

申莹莹1，2，3，郑宏臣2，3，李树芳2,3，付晓平2,3，徐健勇2,3，宋诙2,3*

1(天津科技大学 生物工程学院，天津， 300457)2(中国科学院 天津工业生物技术研究所，工业酶国家工程实验室，天津， 300308)3(中国科学院 天津工业生物技术研究所，天津工业生物系统与过程重点实验室，天津， 300308)

摘要通过对Anoxybacillus sp. LM18-11来源的耐热普鲁兰酶(PulA)与麦芽三糖共结晶的晶体结构分析，在新命名的底物结合域CBM68中预测出4个与底物结合有关的氨基酸位点(Y14、D16、K62和R96)，分别将4个氨基酸位点突变为丙氨酸，得到突变体PulA(Y14A)、PulA(D16A)、PulA(K62A)和PulA(R96A)。其中，突变酶PulA(Y14A) 和PulA(R96A)的底物结合力及催化效率与野生酶PulA相比均有明显降低，其Km值分别比PulA提高了4.2倍和2.5倍，k(cat)/Km 分别为PulA的29%和37%。同时，PulA(Y14A) 和PulA(R96A)的最适作用温度均降低了10 ℃，PulA(R96A)的最适作用pH也降低了0.5个单位。说明Y14和R96是CBM68结构域中的关键氨基酸位点，这两个位点的发现为进一步探究CBM68结构域的作用机制奠定了基础。

关键词耐热普鲁兰酶；CBM68；定点突变；底物亲和力；催化效率

普鲁兰酶是淀粉水解过程中一个重要的脱支酶，能够专一性地水解支链淀粉分支点中的α-1, 6糖苷键[1]。与α-淀粉酶、β-淀粉酶或葡糖淀粉酶共同作用，可使淀粉充分水解为小分子糖，提高淀粉原料的利用率，广泛应用于以淀粉为原料的食品深加工和新生物质能源等工业领域[2-3]。……