羊草茎在奶牛瘤胃中降解特性及其对食糜纤维分解菌数量的影响

徐俊，侯玉洁，赵国琦，罗林广

(1. 江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所，江西 南昌 330200；2. 扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009)



羊草茎在奶牛瘤胃中降解特性及其对食糜纤维分解菌数量的影响

徐俊1,2，侯玉洁1,2，赵国琦2*，罗林广1

(1. 江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所，江西 南昌 330200；2. 扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009)

摘要：本试验旨在研究羊草茎降解特性和紧密吸附于茎的3种主要纤维分解菌的动态变化。选用羊草茎为试验材料，将其纵切6份后装入尼龙袋投入瘤胃中，分别在6，12，24，48和72 h取出，利用扫描电子显微镜观察超微结构变化；取粉碎后羊草茎进行尼龙袋试验，分别在0.5，2，6、12，24，48和72 h取出，测定不同时间点中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)降解率和吸附在茎中3种主要纤维分解菌的数量变化。结果表明，薄壁组织和韧皮部可被瘤胃微生物降解，维管束会伴随薄壁组织的降解而发生脱落。羊草茎和食糜不同时间点纤维分解菌数量均为产琥珀酸丝状杆菌>白色瘤胃球菌>黄色瘤胃球菌，茎中产琥珀酸丝状杆菌和黄色瘤胃球菌数量在24 h达峰值，分别为109和105 copy/g羊草茎，白色瘤胃球菌在12 h达峰值，为108 copy/g羊草茎。瘤胃食糜中3种纤维分解菌的数量在24 h内基本处在一个恒定的水平，而羊草茎NDF降解率在72 h内逐渐提高，羊草NDF降解率与瘤胃食糜中3种纤维分解菌数量不同步，这可能与纤维分解菌分泌的酶活力存在滞后有关。

关键词：羊草茎；纤维分解菌；降解；瘤胃

反刍动物瘤胃栖息着大量微生物，包括细菌、真菌和原虫等，纤维素可被它们降解形成挥发性脂肪酸为机体供能[1]。瘤胃中88%～91%的葡萄糖内切酶和木聚糖酶，70%的淀粉酶和75%的蛋白酶均由紧密吸附的细菌分泌，因此细菌在细胞壁的降解过程中发挥着十分重要的作用[2]。深入研究紧密吸附在纤维中的细菌对于进一步了解纤维的降解具有十分重要的意义。黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌是瘤胃中3种主要的纤维分解菌[3-4]，前人已通过纯培养的方法对其纤维吸附机理进行了大量研究。Mosoni等[5]研究发现，吸附在纤维素上的黄色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌只需45 min即可达到峰值。黄色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌在大麦秸杆(Hordeumvulgare)中的吸附位点各不相同，并且其他非纤维降解菌如栖瘤胃拟杆菌的吸附不影响纤维分解菌的吸附[6]。然而，上述文献多是通过体外法研究纤维分解菌对纤维的降解，无法获悉紧密吸附在纤维内部纤维分解菌的数量随时间的动态变化，并且有关禾本科牧草茎的组织超微结构变化和纤维动态降解率的研究还很少报道。本研究旨在通过尼龙袋技术和扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope，SEM)技术研究羊草(Leymuschinensis)茎在奶牛瘤胃中的动态降解及超微结构变化，同时运用实时荧光定量PCR技术研究紧密吸附在羊草茎和瘤胃食糜中产琥珀酸丝状杆菌、黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌3种主要纤维分解菌的动态变化，为深入研究羊草茎在奶牛瘤胃中的降解规律提供一定的理论依据。

1材料与方法

1.1试验动物和饲养管理

2013年6月，在扬州大学试验农牧场选取3头安装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛(600±15) kg，饲喂主要由玉米青贮、秸秆和精料补充料组成的全混合日粮，栓系式饲养，日喂两次，自由饮水。

1.2电镜样品的制备与观察

收割扬州大学试验农牧场种植的长势和株高相近的抽穗初期羊草3根，剥离得到羊草茎秆部分，在第2节上缘节下2 cm处截取3 cm长片段，纵切为6份，分别放入特制尼龙袋(4 cm×7 cm，孔径48 μm)中，1个尼龙袋只放1段样品，分别在6，12，24，48和72 h取出，在水中轻柔冲洗15 min左右，直到流出的水澄清为止，然后按扫描电子显微镜观测要求制备样品。未放入瘤胃降解的羊草茎于37℃水中浸泡12 h作为对照样观察。扫描电镜的制备参考徐俊等[7]的方法，主要步骤如下：先切除样品2端1 mm左右片段，以消除边缘效应，然后截取2个1 mm的片段，放入2.5%的戊二醛溶液中固定24 h，次日倒掉戊二醛溶液，用磷酸盐缓冲液冲洗3次，各级乙醇脱水，在1∶1的醋酸异戊酯与乙醇混合液中处理30 min，再用纯的醋酸异戊酯处理1 h，经临界点干燥，最后放样品台喷金，用扫描电镜(XL-30，Phillips)观察，照相。

1.3茎尼龙袋降解和瘤胃食糜样品的采集

取羊草茎在65℃下烘干，粉碎过2 mm筛，然后称取3.00 g样品(每个时间点2份)放入尼龙袋(8 cm×12 cm，孔径48 μm)中，于晨饲前投入瘤胃，分别在0.5，2，6，12，24，48和72 h取出，立即放冰水中终止发酵，用冷水冲洗至澄清，然后用力将尼龙袋中的水挤干，-80℃保存，测定NDF降解率和3种主要纤维分解菌的数量。同时采集奶牛饲喂后2，6，12和24 h的瘤胃食糜样品，-80℃保存测定纤维分解菌数量。

1.4纤维分解菌实时荧光定量PCR

取羊草茎和瘤胃食糜样品，分别按照OMEGA植物DNA和粪便DNA提取试剂盒操作说明提取总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度计分析DNA质量及其浓度，本试验测定的纤维分解菌包括黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌，3种纤维分解菌的引物设计如表1所示。PCR产物通过PMD18-T载体连接，然后转入大肠杆菌细胞，根据Omega质粒提取试剂盒提取质粒DNA，送北京信诺金达公司测序分析，序列结果在NCBI上进行比对分析，并利用分光光度计测定质粒中DNA浓度，计算质粒拷贝数。对质粒DNA溶液进行10倍系列稀释，利用 TaKaRa SYBR Green Ⅱ进行实时荧光定量PCR反应，采用20 μL反应体系，反应条件为：95℃预变性2 min，95℃30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。根据拷贝数和对应的Ct值建立标准曲线，对羊草和瘤胃食糜样品中的DNA拷贝数进行定量，然后对每克样品中微生物基因拷贝数取对数值[log copy/g DM stem (digesta)]，计算参照杨金丽等[8]的方法。

表1　细菌名称和引物序列

1.5数据分析

试验结果用Microsoft Excel 2007整理，采用SPSS 17.0中的One-Way Anova进行方差分析，并用Duncan法做多重比较，结果以“平均数±标准差”表示，以P<0.05作为差异显著性标准。

2结果与分析

2.1扫描电镜下羊草茎超微结构变化

图1显示了扫描电镜下羊草茎在奶牛瘤胃内降解0～72.0 h的超微结构变化图。6 h时，羊草茎表面吸附有大量微生物；12 h时，韧皮部组织出现明显的降解(图1C箭头所示)；到24 h时，薄壁组织大部分已被降解；72 h后维管束组织一直未被降解，伴随薄壁组织的降解而发生脱落，羊草茎表皮和厚壁组织基本不降解，72 h后仍保持完整。

2.2羊草茎中纤维分解菌的数量变化

羊草茎紧密吸附的3种主要纤维分解菌在0.5～72.0 h的数量变化如图2所示。由图可知，在不同时间点，3种纤维分解菌数量都是产琥珀酸丝状杆菌>白色瘤胃球菌>黄色瘤胃球菌，降解0.5 h后，上述3种纤维分解菌的数量分别达到107，103和106copy/g羊草茎。细菌在羊草茎降解的前2 h吸附速度最快，产琥珀酸丝状杆菌和黄色瘤胃球菌的数量均在24 h达到峰值，分别为109和105copy/g羊草茎，白色瘤胃球菌数量是在12 h达到峰值，为108copy/g羊草茎。72 h后吸附的纤维分解菌数量相比于各自细菌的峰值都有所下降，且黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌的数量都是显著降低(P<0.05)。

2.3羊草茎NDF动态降解率

羊草茎72 h内NDF动态降解率如图3所示。NDF在前6 h降解速率十分缓慢，这与茎在瘤胃中扫描电镜图片得到的降解结果一致，组织结构前6 h变化不明显，主要是发生细菌的附着。在12～48 h期间，羊草茎薄壁组织开始大量降解，48 h后降解率达到35.89%，随着时间的推移仍在平缓上升，72 h后达到38.78%。与此同时，由扫描电镜可知，72 h后维管束组织将会发生脱落，羊草茎NDF降解率仍会提高。

2.4瘤胃中纤维分解菌的数量变化

瘤胃食糜中3种纤维分解菌24 h内的数量变化如图4所示，与羊草茎中纤维分解菌的数量类似，食糜中3种纤维分解菌的数量也是产琥珀酸丝状杆菌>白色瘤胃球菌>黄色瘤胃球菌，上述3种细菌的数量均值为109,106和104copy/g食糜。 黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌的数量在24 h内各时间点均无显著差异(P>0.05)， 产琥珀酸丝状杆菌是6 h时的数量显著高于其他3个时间点(P<0.05)，总体而言，瘤胃中不同时间点3种纤维分解菌的数量十分稳定。

图1　羊草茎在瘤胃中降解后的扫描电镜图片Fig.1　The structure dynamic changes of L. chinensis stems observed under scanning electron microscope　Epi：对照样品中(0 h)表皮Epidermis；S：厚壁组织Sclerenchyma；V：维管束Vascular；B：维管束鞘Bundle sheath； P：韧皮部phloem；Par：薄壁组织Parenchyma.

图2　羊草茎中紧密吸附的产琥珀酸丝状杆菌、黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌随时间的数量变化Fig.2　Time course of fiber-associated cell number of F. succinogenes, R. flavefaciens, R. albus from 0.5 to 72 h incubation

图3　羊草茎中性洗涤纤维瘤胃72 h降解率Fig.3　NDF digestibility of L. chinensis stem during in situ incubation for 72 h

不同字母代表相同细菌不同时间点差异显著(P<0.05)，下同。 Different letters mean the significant differences atP<0.05，the same below.

3讨论

羊草作为禾本科牧草，细胞壁组织结构和豆科牧草(如苜蓿)存在一定的差异，苜蓿表皮和厚角组织可以完全被瘤胃微生物降解，但羊草组织结构中的表皮和厚壁组织在72 h后仍保持完好[7]。羊草组织结构与同为禾本科的燕麦草类似，都是由表皮、厚壁组织、薄壁组织和维管束等结构组成。但羊草细胞壁结构相比于燕麦草更加致密，这也许是导致其降解速率慢、 NDF降解率低的原因，燕麦草中的维管束在48 h后几乎全部伴随薄壁组织的降解而脱落[9]，但羊草组织中维管束降解72 h后仍未发生脱落，燕麦草茎在48和72 h的NDF降解率分别为40.23%和43.11%，均分别高于羊草的35.89%和38.78%。羊草茎NDF主要包括纤维素、半纤维素和难降解的木质素，羊草细胞壁中非木质化的薄壁组织可被瘤胃内纤维分解菌降解，但木质化程度高的厚壁组织和表皮则无法降解[10]，这是因为木质素可与细胞壁中的多糖形成动物体内的酶难以降解的复合体，限制动物机体对植物细胞壁成分的消化吸收[11]。

图4　奶牛瘤胃中24 h内产琥珀酸丝状杆菌、黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌的数量变化Fig.4　The diurnal changes of F. succinogenes, R. flavefaciens　　 and R. albus in the rumen of cows

在瘤胃微生物中，细菌和真菌可以分泌多种活性很高的纤维降解酶，它们占降解纤维酶活力的80%以上，但由于真菌在总微生物中含量较低(约8%)，对纤维降解的贡献不如细菌大，瘤胃中细菌在对纤维的降解过程中起到了决定性作用，尤其是与饲料颗粒紧密吸附的细菌[12]。研究发现，细菌可以快速附着于黑麦草，且在薄壁组织和韧皮部中的细菌吸附量最多，尤其是黄色瘤胃球菌[13]，本试验中羊草组织结构的降解与之类似，但各时间点均以产琥珀酸丝状杆菌的附着量最多，而非黄色瘤胃球菌，这可能与试验材料和试验动物不同有关。Koike等[14]选择鸭茅(Dactylisglomerata)茎为试验材料，通过竞争性PCR研究了绵羊中3种主要纤维降解菌对鸭茅茎的降解规律，结果表明,在培养5 min后，产琥珀酸丝状杆菌和其他两种球菌的数量可达到105和104copy/g DM，10 min后各细菌数量增加了10倍，且24 h时产琥珀酸丝状杆菌和黄色瘤胃球菌数量达到峰值，分别为109和107copy/g DM，而白色瘤胃球菌需要48 h才达到峰值(106copy/g DM)。此外，产琥珀酸丝状杆菌是瘤胃食糜和鸭茅茎降解中最重要的细菌，本试验结果与上述研究相吻合，但是白色瘤胃球菌在12 h即达到峰值108copy/g DM，且羊草茎和瘤胃食糜中的白色瘤胃球菌数量显著高于黄色瘤胃球菌。

羊草茎NDF降解率随着时间的延长逐渐上升，但与茎中紧密吸附的纤维分解菌数量并不同步，该结果与Koike等[14]报道的结果一致，紧密吸附于纤维的细菌在降解NDF之前还会利用其他底物，如可溶性碳水化合物，与此同时，体外法研究表明，纤维素酶的分泌是由纤维素和木聚糖诱导产生的，这可能是造成NDF降解率与纤维分解菌不同步的主要原因。由瘤胃食糜中3种纤维分解菌的数量变化可知，产琥珀酸丝状杆菌在食糜和羊草茎中均占据主导地位，该结果与Koike和Kobayashi[3]报道的结果一致，绵羊瘤胃中产琥珀酸丝状杆菌数量均高于其他两种球菌数量，而与绵羊采食的日粮无关[15-16]，尽管有报道发现高精料日粮条件会降低瘤胃中产琥珀酸丝状杆菌数量[17]。然而，也有研究表明奶牛瘤胃中白色瘤胃球菌数量比产琥珀酸丝状杆菌更多，且研究还发现不同动物种类也会影响纤维分解菌的群落结构[18]。

4结论

通过对羊草茎组织结构和NDF动态降解率以及紧密吸附的3种主要纤维分解菌的数量变化的研究表明，羊草茎薄壁组织可被降解，但降解速率较慢，细菌可快速吸附于纤维组织，NDF降解率随着时间的延长不断提高，但与瘤胃食糜中的纤维分解菌数量不同步，这可能与纤维分解菌分泌的酶活力滞后有关。

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Kinetics of in situ degradation ofLeymuschinensisstems in the dairy cow rumen and changes in cellulolytic bacteria in digesta

XU Jun1,2, HOU Yu-Jie1,2, ZHAO Guo-Qi2*, LUO Lin-Guang1

1.InstituteofQualitySafetyandStandardsofAgriculturalProducts,JiangxiAcademyofAgriculturalSciences,Nanchang330200,China; 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China

Abstract:In this study, we investigated the degradation characteristics of Leymus chinensis stems in the dairy cow rumen and evaluated the changes in cellulolytic bacteria during the degradation process. L. chinensis stems were cut and packed into six nylon bags, which were incubated for 6, 12, 24, 48, and 72 h in the rumen of a dairy cow. Changes in the ultra-structure of L. chinensis stems during digestion in the rumen were evaluated by scanning electron microscopy. L. chinensis stems incubated for 0.5, 2, 6, 12, 24, 48, and 72 h in the rumen were evaluated to determine their neutral detergent fiber (NDF) digestibility. The cellulolytic bacteria in these digesta samples were also analyzed. The results showed that the non-lignified parenchymal tissue and phloem were quickly degraded and the vascular bundle was released from the plant tissues after degradation of the parenchymal tissue. The main bacterial species attached to the stem tissues were Fibrobacter succinogenes>Ruminococcus albus>Ruminococcus flavefaciens. The numbers of these bacteria peaked at 24 h (109/g dry matter for F. succinogenes and 105/g for R. flavefaciens) or 12 h (108/g DM for R. albus) of digestion in the rumen. The numbers of cellulolytic bacteria in digesta remained constant after 24 h, while the disappearance of NDF from the L. chinensis stems showed a linear increase up to 72 h of digestion. These results suggest that the disappearance of NDF from the L. chinensis stem is not synchronized with changes in the populations of cellulolytic bacteria in digesta, and may instead be related to a delayed increase in the activities of fibrolytic enzymes.

Key words:Leymus chinensis stem; cellulolytic bacteria; degradation; rumen

*通信作者

Corresponding author. E-mail：gqzhao@yzu.edu.cn

作者简介：徐俊(1986-)，男，江西南昌人，助理研究员。E-mail:xujun0125@163.com

基金项目：十二五国家科技支撑计划(2011BAD17B03)和国家自然科学基金(31560647)资助。

*收稿日期：2015-06-10；改回日期：2015-08-24

DOI：10.11686/cyxb2015298

http://cyxb.lzu.edu.cn

徐俊, 侯玉洁, 赵国琦, 罗林广. 羊草茎在奶牛瘤胃中降解特性及其对食糜纤维分解菌数量的影响.草业学报, 2016, 25(4): 166-171.

XU Jun, HOU Yu-Jie, ZHAO Guo-Qi, LUO Lin-Guang. Kinetics of in situ degradation ofLeymuschinensisstems in the dairy cow rumen and changes in cellulolytic bacteria in digesta. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(4): 166-171.