五味子、百部提取物消除耐环丙沙星大肠杆菌耐药性的研究

林树乾　李晓柳　宋敏训

摘要：采用影印培养法，以浓度为1/2MIC的五味子水煎液、五味子醇提物、百部水煎液、百部醇提物对耐环丙沙星大肠杆菌作用24 h，观察作用前后大肠杆菌对环丙沙星的耐药性变化。结果表明：五味子水煎液、五味子醇提物、百部水煎液、百部醇提物对临床分离耐药菌株均无明显耐药性消除作用，五味子水煎液、五味子醇提物对人工诱导耐药菌株有一定的耐药消除作用。

关键词：大肠杆菌；五味子；百部；耐药消除；环丙沙星

中图分类号：S853.74文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）08-0134-03

AbstractThe tolerance of Escherichia coli to ciprofloxacin was observed after treated with 1/2MIC of Chinese Magnolcavine Fruit and Stemonae Radix extracts using replica plating. The extracts were obtained through decocted by water and ethanol respectively. The results showed that the Chinese Magnolcavine Fruit and Stemonae Radix extracts had no significant eliminating effects on drug tolerance of clinical isolates of E. coli， but the decocted and ethanol extracts of Chinese Magnolcavine Fruit had elimating effects of artificial induced drug-resistant strains in some extent.

KeywordsEscherichia coli；Chinese Magnolcavine Fruit；Stemonae Radix； Eliminating drug tolerance；Ciprofloxacin

随着抗生素越来越广泛应用于临床治疗大肠杆菌病，临床上出现了更多的大肠杆菌耐药菌株，使得很多抗生素失去了原有的治疗效果[1]。目前，人们在努力发现新抗生素的同时，也在寻求消除细菌耐药性的方法[2]。国内亦有人开展了中药消除细菌耐药性的研究。鞠洪涛[3]报道大蒜油对大肠杆菌氨苄青霉素耐药性有消除作用；王云等[4]用马齿苋、金银花提取液对绿脓杆菌PA11株R质粒进行体内消除研究，结果显示两种药作用24 h均未获得消除作用，作用48 h和72 h R质粒平均消除率马齿苋为2.15%、金银花为12.25%；康梅等[5]用三黄片对大肠杆菌多重耐药株进行质粒消除试验，发现三黄片对耐药质粒有较强的消除作用；陈群等[6]在用黄芩与止痢灵对大肠杆菌R质粒消除作用的研究中发现黄芩和止痢灵对大肠杆菌携带的R质粒具有消除作用，其消除率为2.42%和2.14%；雷连成等[7]发现黄连提取物 （IT2）对大肠杆菌的部分耐药性具有良好的抑制作用。

然而，关于中药消除细菌耐药性的研究尚处于探索阶段，目前人们仍在致力于发现更多更有效的对宿主本身无害的能消除细菌耐药性的中药制剂。本试验选择五味子及百部不同提取物来消除自然的和人工诱导的大肠杆菌耐药性，以期为筛选有效中药消除剂提供基础。

1材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1试验菌株本试验所用大肠杆菌天然耐药菌株为临床分离鉴定的鸡源大肠杆菌耐环丙沙星菌株，由山东省农业科学院家禽研究所提供。用于进行人工诱导耐药菌株为标准菌株CMCC44102，购自中国兽医药品监察所。

1.1.2试验药物环丙沙星药敏片购自杭州天和微生物试剂有限公司；环丙沙星标准品购自中国药品生物制品检定所；五味子、百部均购自山东建联中药店。

1.1.3试验试剂营养琼脂培养基购自北京奥博星生物技术有限公司；LB培养基购自OXOID公司。

1.1.4试验仪器pH测定仪、高压锅、电子天平、电炉、超净工作台、酒精灯、恒温培养箱、冰箱。

1.2试验方法

1.2.1试验菌株准备①菌株活化：吸取冻存菌株10 μL放入4 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养18 h，再将培养液用无菌生理盐水稀释至0.5麦氏比浊管浑浊度，即菌液浓度为3×108 CFU/mL，按照标准方法将其再稀释1 000倍用于测定环丙沙星标准品溶液的MIC。

②临床分离的天然耐药菌株的耐药性检测：采用K-B法测定试验菌株对环丙沙星的耐药性，观察含药纸片周围有无抑菌圈，并测量抑菌圈直径。采用试管二倍稀释法，以400 μg/mL环丙沙星水溶液为首浓度，倍比稀释至0.78125 μg/mL，测定环丙沙星对试验菌株的MIC。

③标准菌株的人工耐药诱导：采用肉汤稀释法，以10 μg/mL环丙沙星水溶液为首浓度倍比稀释至0.01953 μg/mL，测定环丙沙星对标准菌株的MIC。以1/2MIC作为诱导耐药浓度，然后逐步增加药物浓度使其耐药浓度达到10 μg/mL。

1.2.2中药提取物的制备①水煎液的制备：取五味子、百部各100 g，加入十倍量蒸馏水浸泡0.5 h，煎煮1.0 h，过九号药典筛，然后再加入十倍量蒸馏水煎煮1.0 h，过九号药典筛，合并滤液，浓缩至每1 mL含生药1 g，高压灭菌后4℃保存备用。

②醇提物的制备：取五味子、百部各100 g，加入十倍量80%乙醇浸泡0.5 h，加热回流提取1.0 h，过九号药典筛。向药渣中再加入十倍量80%乙醇，将以上过程重复1次，合并滤液。45℃旋蒸去除乙醇，浓缩至每1 mL含生药1 g，高压灭菌后4℃保存备用。

1.2.3中药提取物的耐药消除试验①中药提取物MIC测定：采用试管二倍稀释法测定不同中药提取物对受试菌株的MIC。取12支无菌试管编号（1～12号），各加入LB培养基1 mL，取1mL中药原液置于第1号试管中，均匀混合，然后取出1 mL加入2号试管中，依次稀释至10号管，弃去1 mL，在1～11号管中加入3×105 CFU/mL菌液1 mL，在12号管中仅加入1 mL中药原液。第11号管作为不加药物的菌液对照管，第12号管作为只加药液不加菌液的药物对照管。置于37℃恒温振荡器中培养18 h后观察结果。

② 耐药消除结果测定：选择1/2MIC作为耐药消除试验的药物浓度，方法同1.2.3①，加入同样浓度和体积的菌液，分别在37℃恒温培养24 h，取培养后菌液加入LB培养基中继续培养18 h，并将菌液稀释至3×103 CFU/mL，用无菌玻璃棒均匀涂布在营养琼脂培养基上，37℃恒温培养18 h，采用影印培养法[8]将营养琼脂培养基上的菌落影印在含环丙沙星的培养基和不含环丙沙星的培养基上，37℃培养24 h，对比观察菌落消除结果。用无菌接种环勾取在含环丙沙星平板上消除而在不含环丙沙星平板对应位置生长的菌落，采用K-B法测定该类菌株对环丙沙星的耐药表型及MIC变化情况。

2结果与分析

2.1试验菌株的耐药性

经K-B法测定临床分离的天然耐药菌株对环丙沙星抑菌圈为0，标准株经人工诱导耐药后的抑菌圈为12.50 mm。试管二倍稀释法测定环丙沙星对临床分离的天然耐药菌株的MIC为100 μg/mL，对未经诱导的标准菌株CMCC44102的MIC为0.039 μg/mL，对标准菌株经人工诱导后的MIC为10 μg/mL。

2.2耐药消除试验结果

2.2.1中药提取物的MIC测定结果采用试管二倍稀释法测定不同中药提取物对受试菌株的MIC，结果为五味子水煎液对受试菌株MIC均为0.0039 g/mL，五味子醇提物对受试菌株MIC均为0.0078 g/mL，百部水煎液对受试菌株MIC均为0.5 g/mL，百部醇提物对受试菌株MIC均为0.5 g/mL。

2.2.2中药耐药消除结果测定采用影印培养法观察影印后菌落消失情况，挑选在普通平板上生长但是在含环丙沙星平板对应位置未生长的菌落进行耐药表型及MIC测定，结果显示：五味子水煎液、五味子醇提取处理后的临床分离菌株耐药抑菌圈无变化，MIC值无变化，人工诱导耐药菌株耐药抑菌圈扩大为14.24～14.50 mm，MIC值由10 μg/mL降至5 μg/mL，提示五味子可能有耐药消除作用；百部水煎液和醇提取物对临床分离耐药菌株和人工诱导耐药菌株均无耐药消除作用。

3讨论与结论

目前临床上大肠杆菌病大多采用抗生素药物进行治疗。喹诺酮类抗生素是近年来发展较快的一类人工合成抗菌药物，其抗菌治疗作用仅次于头孢类。但是随着其在我国集约化、规模化养殖场中被大量应用，造成大肠杆菌耐喹诺酮类菌株越来越严重并广泛传播。

中药抑制细菌耐药性的研究近年来一直都是热门话题，而且不同研究者通过试验证明，清热解毒类药物、清热燥湿类药物，如黄芩、黄连、黄柏、金银花、马齿苋、射干等，均有不同程度的耐药消除作用[9，10]，但同种中药在不同研究中有较大差异，这可能与中药消除无标准的测定指标和试验方法有关。而且目前中药对细菌耐药性消除的具体机制尚不明确，相关研究还处于起步阶段，有大量工作要做。

本次试验为试图寻找有效中药消除剂的初步研究，试验过程中制作了改良影印培养工具，使得以后的筛选试验能省时省力，节约资源。本试验初步证明了五味子对人工诱导菌株具有一定耐药消除作用，但是其对临床分离菌株并无耐药消除作用，这可能与菌株耐药性强弱有关，同时也可能与具体的耐药消除机制不同有关。总之，本试验的过程及结果为寻找有效的细菌耐药性消除剂打下基础。

参考文献：

[1]李淑梅，杨帆，刘兴友.抗生素与动物免疫研究进展[J].畜禽业，2005（7）：36-37.

[2]方有仪，才让措，钱俊栋.中药消除细菌耐药性研究进展[J].中兽医医药杂志，2014（4）：28-30.

[3]鞠洪涛.中草药消除大肠埃希氏菌耐药性及耐药质粒的研究[J].中国兽医科技，2000，30（3）：27-29.

[4]王云，于军，关显智，等.马齿苋、金银花提取液对绿脓杆菌PA 11株R质粒体内消除作用的比较[J].中国微生态学杂志，2000，12（4）：197-198.

[5]康梅，陈知行，许秀成，等.三黄片对大肠杆菌耐药质粒消除作用的研究[J].华西药学杂志，1999，14（5-6）：406-408.

[6]陈群，王胜春.黄芩与止痢灵对大肠杆菌R质粒消除作用的研究[J].中国微生态学杂志，1998，10（2）：80-82.

[7]雷连成，韩文瑜，段艳.大肠杆菌耐药性抑制剂的初步研究[J].中国兽药杂志，2004，38（2）：18-21.

[8]徐民俊，田小群，周世宁.一种改进的平板影印工具及其应用[J].微生物学报，2008，48（5）：657-660.

[9]蒋培余.中药抑制剂逆转细菌耐药性的研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2008（10）：53-55.

[10]刘立新，刘芳萍，李睿，等.中药消除细菌耐药性的研究进展[J].畜牧兽医科技信息，2008（5）：15-16.