双波长双指示剂催化光度法测定牛奶中的痕量铁

王伟华　张坤

摘要：以酸性介质中痕量铁（III）催化的双氧水氧化中性红和亚甲基蓝褪色原理为基础，建立了双波长双指示剂催化动力学光度法测定痕量铁的新方法。确定的最佳试验条件为HCI用量为0.5 mL，亚甲基蓝用量为3 mL，中性红用量为0.4 mL，3%的双氧水用量为0.5 mL，反应时间为8 min，反应温度为100℃，线性范围为0.4～20.0ug/L，回收率在85%-89%之间，将该方法与经典原子吸收光度法相比，具有反应时间短、准确度高、精确度好的优点，适合牛奶中痕量铁的检测。

关键词：痕量铁；双波长；双指示剂；催化光度法；牛奶

人体内65%的铁存在于血液中，70%～75%的铁以血红素蛋白质的形式存在，主要有血红蛋白、肌红蛋白及部分酶。25%～30%的铁为非血红素铁，有铁蛋白、血铁黄素及部分酶。铁蛋白和血铁黄素是储存铁的基本形式，主要存在于肝脏、网状内皮细胞和骨髓中。前者为水溶性，适应于短期快速储存的需要，后者为脂溶性，可适应于较长期限的铁储存。在缺铁性贫血发生前，储存铁就几乎全部耗竭。铁的主要生理功能是通过血红蛋白运输氧和二氧化碳，还通过肌红蛋白起固定和储存氧的作用。当人缺铁时，不仅血红蛋白、肌红蛋白等的合成受阻，而且使氧的运输与储存、二氧化碳的运输与释放、电子传递、氧化还原反应等代谢过程发生紊乱，出现各种症状。当日粮中铁含量长期低于10 mg/kg时，就会引起血红蛋白含量降低，红细胞减少，造成缺铁性贫血。铁等微量元素在奶牛的生理生化过程中起非常重要的作用，直接影响到奶牛的健康状况，作为牛奶中重要的营养元素，铁也影响到牛奶的品质。测定铁的方法很多，早期以比色法和分光光度法为主，20世纪50年代后发展了原子吸收分光光度法（成本高）、溶出伏安法（费时）、高效液相色谱法（成本高）、x光-萤光分析法（灵敏度差）等技术。

动力学分析法是利用反应速度和反应物浓度、催化剂之间的关系而进行定量分析的方法，与传统的热力学方法不同，它一般利用较慢的化学反应作指示反应，它的测量在体系达到平衡状态之前进行，扩大了可利用的化学反应范围。动力学分析法最初用于生物化学、放射化学和气相扩散等研究，已有70多年的历史，早期发展较慢。直到上世纪60年代才引起了分析化学界的重视，开展了大量动力学分析法的研究。近年来分析仪器日趋自动化，其应用于分析化学的各分支学科也愈来愈广泛，研究者阐述了动力学在分析化学中的应用及发展。在催化动力学分析法中，常用的检测手段有光度法、荧光法、电化学分析法、电位法等。其中光度法因操作简单，灵敏度高，选择性好成为催化法中应用广泛的方法。与传统的热力学平衡法相比，动力学方法具有反应选择性好、灵敏度高、应用范围广等优点。

本研究在盐酸介质中，利用铁催化过氧化氢氧化亚甲基蓝和中性红褪色的指示反应，通过测定520 nm和660 nm下吸光度的变化及其与铁浓度的线性关系，建立了双波长测定痕量铁的新方法。该方法操作简单、灵敏度高、选择性好、不用分离可直接测定牛奶中的痕量铁。本研究旨在建立准确可靠的检测方法，为对痕量铁的检测和监控提供参考。

1.材料与方法

1.1材料与试剂

牛奶材料为新农牌牛奶（百利包），市售。中性红、亚甲基蓝、硫酸铁、硝酸、盐酸、过氧化氢、硫脲等均为国产分析纯。

1.2试验设备

通风橱，湖南奥立龙现代实验室设备有限公司：箱式电阻炉，上海跃进医疗器械厂；万用电子炉，上海科恒实业发展有限公司：TSA-990型原子吸收分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司：TM-1900型双束光紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司：HG214-FC104型电子分析天平，北京百万电子科技中心。

1.3试验方法

1.3.1吸光度测定 在两支25 mL比色管中加入0.5 mL HCl、3 mL亚甲基蓝溶液、0.4 mL中性红溶液、0.5 mL双氧水，其中1支加入铁（III）标准工作溶液（催化反应，吸光度为A），另1支不加铁标准工作溶液（非催化反应，吸光度为An），用水稀释至刻度，摇匀。置于沸水浴中，加热8 min，迅速取出，用自来水冲淋冷却，使反应停止。以蒸馏水作参比，在520 nm和660 nm波长处分别测定非催化和催化体系的吸光度A520n、A660n、A520、A660，并计算吸光度差值，△A520=A520n-A520，△A660=A660n-A660，△A=△A520+△A660。

1.3.2盐酸用量的选择 取10支试管分成2组，每组5支，分别加入0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL的盐酸溶液，再加入3 mL亚甲基蓝溶液、0.4 mL中性红溶液、0.5 mL双氧水，其中一组加入铁（III）标准工作溶液（催化反应，吸光度为A），另一组不加铁标准工作溶液（非催化反应，吸光度为Ao），用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。测吸光度。

1.3.3亚甲基蓝用量的选择 取12支试管分成2组，每组6支，两组分别加入1、2、3、4、5、6 mL的亚甲基蓝溶液，再加入0.5 mL HCl、0.4 mL中性红溶液、0.5 mL双氧水，其中一组加入铁（III）标准工作溶液（催化反应，吸光度为A），另一组不加铁标准工作溶液（非催化反应，吸光度为Ao），用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。测吸光度。

1.3.4中性红用量的选择 取14支试管，分成2组，每组7支，两组分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL的中性红溶液，再加入0.5 mL HCl、3 mL亚甲基蓝溶液、0.5 mL双氧水，其中一组加入铁（III）标准工作溶液（催化反应，吸光度为A），另一组不加铁标准工作溶液（非催化反应，吸光度为An），用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。测吸光度。

1.3.5双氧水的用量选择 取10支试管，分成2组，每组5支，两组分别加入0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL的体积分数3%的双氧水，再加入0.5 mLHCl、3 mL亚甲基蓝溶液、0.4 mL中性红溶液，其中一组加入铁（III）标准工作溶液（催化反应，吸光度为A），另一组不加铁标准工作溶液（非催化反应，吸光度为An），用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。测吸光度。

1.3.6时间对反应体系的影响 取10支试管，分成2组，每组5支，一组加入0.5 mL HCl、3 mL亚甲基蓝溶液、0.4 mL中性红溶液、0.50 mL双氧水，其中1支加入铁（III）标准工作溶液（催化反应，吸光度为A），另1支不加铁标准工作溶液（非催化反应，吸光度为An），用水稀释至刻度，摇匀。置于沸水浴中，每组分别加热3、4、5、6、7、8 min后，迅速取出，用自来水冲淋冷却，使反应停止。测吸光度。

1.3.7温度对反应体系的影响 取12支试管，分成2组，每组6支试管，两组的加热温度分别为50、60、70、80、90、100℃，再加入0.5 mL HCl、3.0 mL亚甲基蓝溶液、0.4 mL中性红溶液，其中一组加入铁（III）标准工作溶液（催化反应，吸光度为A），另一组不加铁标准工作溶液（非催化反应，吸光度为A。），用水稀释至刻度，摇匀。加热8 min，迅速取出，用自来水冲淋冷却，使反应停止。测吸光度。

1.3.8铁标准曲线的确定 取10支试管，分成5组，2支一组，分别加入0.5 mL HCl、3.00 mL亚甲基蓝溶液、0.40 mL中性红溶液、0.50 mL双氧水，每组中其中1支加入铁（III）标准工作溶液（催化反应，吸光度为A），另1支不加铁标准工作溶液（非催化反应，吸光度为An），用水稀释至刻度，摇匀。铁标准液的浓度分别为0、0.006、0.009、0.012、0.015ug/mL，置于沸水浴中，加热8 min（秒表计时）后，迅速取出，用自来水冲淋冷却，使反应停止。测吸光度。

1.3.9样品的制备 取干净瓷坩埚置高温炉中，在500～550℃下灼烧0.5 h，移至炉口冷却至200℃以下取出，放在干燥器中冷却至室温，精密称量，并重复灼烧至恒重。

加入5～10 g牛奶样品后，精密称量。把盛有牛奶的坩埚置于电炉上，小心加热使样品充分碳化至无黑烟产生，然后置高温炉中，在500～550℃灼烧至无碳粒，灰化完全。冷却至200℃以下后取出放入干燥器中冷却至室温，称量。重复灼烧至前后两次称量相差不超过0.5 mg为恒重。

1.3.10牛奶样品中铁含量的测定 200 mL牛奶得灰分1.29 g。用稀盐酸溶解，定容在100 mL容量瓶中，取两支试管，1支加入样品溶液，另1支不加。测吸光度。

1.3.11重现性的测定 将试验中的铁标准工作溶液换成样品，同时做空白溶液对比，测定其吸光度，求△A。分别作6组，比较每次的试验结果。

1.3.12稳定性的测定 将铁标准工作溶液换成样品提取液，同时做空白溶液，测定其吸光度，计算出△A。每隔4h测1次，观察结果变化情况。

1.3.13回收率测定 取6支比色管，分成3组，每组2支试管。每组的2支试管，第一组1支加上样品提取液，再加上5ug/L铁标准工作溶液，另1支不加，作空白对照，第二组1支试管加上样品提取液，再加上10ug/L的铁标准工作溶液，另1支不加，作空白对照，第三组1支试管加上样品提取液，再加上20ug/L的铁标准工作溶液，另1支不加，作空白对照。分别测定吸光度，计算△A。

1.3.14原子吸收法Fe标准曲线的确定 吸取铁的浓度为0、0.5、1.0、2.0、3.0ug/mL的铁标准使用液，分别置于100mL容量瓶中，以0.5 mol/L的硝酸稀释至刻度，混匀，将处理好的样品溶液、试剂空白液和铁标准溶液分别导人火焰原子化器进行测定，记录其对应的测量值。

1.3.15原子吸收法测定样品中铁的含量 称取0.675 2 g灰分用稀硝酸溶解，100 mL容量瓶中定容，按仪器说明书的操作步骤进样测定。

2.结果与分析

2.1吸收曲线的确定

按照“1.3.1”的方法，分别配置催化和非催化体系溶液，以水为参比，在400～800 nm范围内分别测定吸光度A，绘制吸收曲线（图1）。在催化和非催化体系中均有两个吸收峰，其最大吸收波长在520 nm和660 nm处，它们分别对应于中性红和亚甲基蓝的最大吸收波长，且在520nm和660 nm处△A最大。故分别选用520 nm和660 nm为测定波长。

2.2反应介质及用量的确定

按“1.3.2”的方法，考察HCl、H2SO4、HNO3等不同介质对反应体系的影响。结果表明，以HCl为介质灵敏度最高，并且当0.01 mol/LHCl用量为0.5 mL时，有较大而稳定的△A。故选用0.5 mL0.01 moI/LHCl为反应介质（图2）。

2.3亚甲基蓝和中性红溶液用量的确定试验

按照“1.3.3”和“1.3.4”的方法进行试验，结果（图3、图4）表明，随着亚甲基蓝和中性红溶液用量的增大，△A都呈先增大后减小的趋势，当亚甲基蓝和中性红溶液的用量分别为3 mL和0.4 mL时，△A最大。所以本试验选取亚甲基蓝和中性红溶液的量分别为3mL和0.4mL。

2.4双氧水用量的确定

按照“1.3.5”的方法进行试验，结果表明，随着双氧水用量的增大，△A先增大后减小，发现0.5 mL3%的双氧水对Fe³⁺的催化最明显，△A最大，所以本试验选用0.5 mL 3%的双氧水（图5）。

2.5时间对反应体系的影响

按照“1.3.6”的方法进行试验，结果表明，反应时间从3 min开始△A逐渐增大，当反应到8 min时△A出现最大，当反应时间再增加△A基本不变。因此本试验选8 min为反应时间（图6）。

2.6温度对反应体系的影响

按照“1.3.7”的方法，测定不同温度下的△A（图7）。结果表明，反应速度随着温度的增加明显加快，当温度超过80℃时，反应速度基本不再变化。

2.7铁溶液标准曲线的确定

改变铁（III）的浓度，按照“1.3.8”的方法进行试验。结果表明，铁（III）的质量浓度在0.4～20ug/L的范围内与△A呈线性关系，标准曲线的回归方程为△A=57.523 OP-0.006 2（r=0.994 4，极显著）。

2.8样品分析

2.8.1共存离子的影响 在试验条件下，对铁（III）进行测定，当相对误差绝对值小于0.5%时，以下共存离子不干扰测定：1 000倍的钡离子、钙离子、钾离子、磷酸根离子、镁离子；500倍的钠离子、锌离子、锡离子；250倍的铝离子、铅离子、锰离子；50倍的碘离子，10倍的Cr（VI）、Ni²⁺；5倍的se（IV）、Co²⁺；1倍的Cu²⁺。除了等量的Cu²⁺有干扰外，大部分离子允许量较高。本试验加入1.5 mL的1.0 g/L硫脲作掩蔽剂，Cu²⁺的允许量可增加到40倍。

2.8.2样品中铁含量的测定结果 按照“1.3.9”和“1.3.10”的方法，测得△A=0.806，根据铁溶液标准曲线，计算得牛奶中铁的含量为0.007 1ug/mL。

2.8.3重现性的测定 按照“1.3.11”的方法进行重现性试验，结果（表1）表明，6组样品测定结果变异系数为6.85%，说明该方法的重现性较好。

2.8.4稳定性试验结果 按照“1.3.12”的方法进行稳定性试验，结果（表2）表明，溶液放置时间在较长时间时，稳定性较好。

2.8.5回收率的试验 按照“1.3.13”的方法进行回收试验，结果（表3）表明，回收率为85.0%～89.0%。

2.8.6原子吸收法测牛奶样品中的铁

按照“1.3.14”的方法，得到原子吸收法Fe的标准曲线，y=0.185 6x-0.029 3（r=0.993 9，极显著）。按照“1.3.15”的方法，测得△A=0.086。根据标准曲线上计算铁的含量为0.618 9ug/mL，换算出所测牛奶中铁的含量为0.006 3ug/mL。

3.结论

双波长双指示剂催化动力学光度法测定牛奶中痕量铁的最佳反应条件为盐酸0.5 mL、亚甲基蓝3 mL、中性红0.4 mL、3%的双氧水0.5 mL、反应时间8 min，反应在沸水浴中进行。对于相同样品，用原子吸收法测得的铁含量为0.006 3ug/mL，用双波长催化动力学光度法测得的铁的含量为0.0071ug/mL。本试验方法重现性和稳定性均较好，仪器比较稳定，回收率较高，省事、省时、省力，操作安全，可用于痕量铁的测定。