乳酸对铜绿微囊藻的抑藻效应及机理

彭桂莹,陈永玲,韩玉珍,张庭廷(安徽师范大学生命科学学院,安徽省皖江城市带退化生态系统的恢复与重建协同创新中心,安徽 芜湖 241000)



乳酸对铜绿微囊藻的抑藻效应及机理

彭桂莹,陈永玲,韩玉珍,张庭廷*(安徽师范大学生命科学学院,安徽省皖江城市带退化生态系统的恢复与重建协同创新中心,安徽 芜湖 241000)

摘要：以铜绿微囊藻为实验对象,研究了乳酸对铜绿微囊藻的抑藻效果及可能的抑藻机理.结果表明乳酸对铜绿微囊藻的生长有很强的抑制作用,72h,除最低浓度实验组对铜绿微囊藻的抑制率为60%外,其余浓度实验组的抑制率均达到了80%以上;在乳酸胁迫下,藻液中核酸和蛋白质含量增加,电导率上升,细胞中丙二醛(MDA)和氧自由基(O2•)含量增加,超氧化物歧化酶(SOD)活性下降;透射电镜图片显示,细胞的超微结构发生了明显改变.推测乳酸可能的抑藻机理是改变了藻细胞膜的通透性及其细胞结构,降低了其抗氧化能力,最终使得藻细胞裂解死亡.

关键词：乳酸；铜绿微囊藻；抑藻效应；抑制机理

* 责任作者, 教授, cyhztt@mail.ahnu.edu.cn

水体富营养化现象,已成为日益严重的全球性水环境污染问题之一[1].目前,利用天然植物产生的次生代谢物进行抑藻是环境领域研究的热点.如沉水植物穗花狐尾藻分泌的焦性没食子酸被认为是一种抑藻效应较强的化感物质[2],而Zhang等[3]从普生轮藻中分离到的亚油酸等也同样表现出非常好的抑藻作用;张庭廷等[4]对17种不同结构脂肪酸的抑藻效应研究发现所有脂肪酸均有不同程度的抑藻作用.但脂肪酸和酚酸类化感物质在应用时有一个重要的瓶颈,即难溶问题,因此,寻找那些易于溶解且具有良好抑藻效果的天然低毒或无毒代谢物进行蓝藻水华的防治就显得异常重要.

乳酸(2-羟基丙酸)是某些植物无氧呼吸的代谢产物,已有相关报道认为乳酸是一些植物的化感成分之一,如Xian等[5]分析3种沉水植物分泌的化感物质成分时,在金鱼藻、黑藻和苦草的水培液中都检测到了含量相对较高的乳酸;王红强等[6]也从伊乐藻的水浸提液中检测到了乳酸成分.此外,乳酸可作为食品添加剂、防腐剂,且无异味,能与水任意互溶,可以方便地直接投入水体使用.因此,采用乳酸进行抑藻不仅具有较好的生态安全性且使用方便,易于操作,具有较高的可行性.

为此,本研究利用单纯的天然产物乳酸对水华最常见的蓝藻—铜绿微囊藻进行抑藻实验并测定了其抑藻机理,力求为富营养化水体蓝藻水华防治提供新的研究思路和有用参考.

1　材料与方法

1.1 实验材料

铜绿微囊藻PCC7806(Microcystis aeruginosa PCC7806) 购自中国科学院水生生物研究所藻种库,采用BG-11培养基进行培养.培养条件为4000lx 的光照强度,光暗比为12h:12h,温度为(25±1)℃.实验前一周,铜绿微囊藻进行扩大培养,使得细胞进入对数生长期.

乳酸为分析纯,含量99%,购自于上海国药集团.

1.2 实验仪器

超净工作台;Motic数码显微镜;血球计数板;光照培养箱PGX-250B;离心机;TGL-16G冷冻离心机;721型分光光度计等,Jeol 1230透射电镜. 1.3 实验方法

1.3.1 乳酸对铜绿微囊藻的抑藻实验 根据预实验的结果,在已灭菌的锥形瓶中(250mL)加入铜绿微囊藻藻液100mL,藻的初始密度为1.3× 106cells/mL,然后向其中加入一定量的乳酸,乳酸设置5个浓度梯度,分别为12.5,25.0,50.0,100.0, 200.0µL/L(由于加入的乳酸量非常小,对藻液的密度几乎没有影响,故其体积可以忽略不计).另外设置不含乳酸的空白对照组,各实验组与对照组均3个平行,置于1.1相同条件下培养.

通过血球计数板对藻细胞进行计数来反映乳酸对铜绿微囊藻生长的影响,每24h计数一次,统计至96h.

通过藻细胞密度计算出乳酸对铜绿微囊藻的百分抑制率(Inhibition Ratio).抑制率的计算公式为:

式中:IR表示抑制率;N表示处理组的铜绿微囊藻的藻密度,cells/mL;N0表示对照组的铜绿微囊藻的藻密度,cells/mL.

1.3.2 乳酸对铜绿微囊藻的部分抑制机理研究及相关参数的测定 根据1.3.1的抑藻结果,对机理的测定,设置了4个乳酸浓度梯度,分别为12.5,25.0,50.0,100.0µL/L,其他处理方法同上,初始藻密度为5.35×106cells/mL.24h后测定各种机理参数,此后每隔48h测定一次,总共测定3次.

细胞膜通透性通过测定细胞外液电导率、OD260、OD280变化[7]来反映.OD260反映的是藻液中核酸的含量;OD280反映的是藻液中蛋白质的含量.

参照Health等[8]硫代巴比妥酸TBA比色法测定丙二醛(MDA)含量.丙二醛是膜脂过氧化作用的最终分解产物,其含量可以反映细胞遭受逆境伤害的程度.实验时分别测定反应产物在不同光波长处的吸光值,计算丙二醛的浓度和含量.

超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定参考修改的Stewert等[9]的方法.SOD是普遍存在于生物体内的一种清除超氧阴离子自由基的酶.通过测定反应后反应液在560nm处的吸光值,计算出酶活性的大小.

藻细胞超微结构的透射电镜分析:于实验第3d收集铜绿微囊藻,离心,弃上清,0.1mol/L PBS清洗2次.加2.5%戊二醛过夜固定后,用0.1mol/L PBS清洗2次,再经1%锇酸后固定5h,0.1mol/L PBS清洗数次后,丙酮梯度浓度脱水,Epon812 树脂梯度浸透包埋,在60℃恒温箱聚合成包埋块, 在Leica UC6超薄切片机上切片,切片经醋酸铀和柠檬酸铅染色后在Jeol 1230透射电镜上观察拍照(透射电镜分析由上海釜诚生物科技有限公司协助完成).

1.4 数据处理

数据采用SPSS 21.0和Excel 2010软件处理,对组间数据的差异进行多重比较分析,大写字母表示P<0.01,说明有极显著性差异;小写字母表示P<0.05,说明有显著性差异.

2　结果与分析

2.1 乳酸对铜绿微囊藻生长的影响

由表1可知,乳酸对铜绿微囊藻的抑制率随着乳酸浓度的增加而增大;同一浓度下,随着处理时间的加长而增大.除去最低浓度处理组,其余浓度的处理组抑制率在第72h后均超过了80%,在第96h后均超过了90%,最大乳酸浓度(200.0µL/L)组,在第96h抑制率可以达到99.58%,接近100%.由此可以看出,乳酸对铜绿微囊藻有很好的抑制作用.

表2中数据显示的是对不同处理时间所得的数据进行的Pearson相关性分析.可以看到表中大多数据的R≥0.8, P≤0.05.由此可以表明乳酸浓度与抑制效果呈正相关,即乳酸浓度越大,抑制率越大.

表1　乳酸对铜绿微囊藻的抑制率Table 1　The Inhibition ratio of lactic acid on M.aeruginosa

表2　乳酸浓度与抑制率的相关性Table 2　The correlation between lactic acid concentration and inhibition ratios

2.2 乳酸对铜绿微囊藻的抑制机理

表3　乳酸对铜绿微囊藻藻液核酸含量的影响Table 3　The effect of lactic acid on nucleic acid contents in the supernatant of M.aeruginosa

表4　乳酸对对铜绿微囊藻藻液蛋白质含量的影响Table 4　The effect of lactic acid on protein contents in the supernatant of M.aeruginosa

2.2.1 乳酸对铜绿微囊藻细胞膜通透性的影响 表3、表4和图1分别显示的是铜绿微囊藻藻液中核酸含量(OD260)、蛋白质含量(OD280)以及电导率的变化.可以看出,对照组中核酸和蛋白质含量基本保持稳定,而各处理组藻液中核酸含量和蛋白质含量都随着乳酸浓度的增大而增加,且随着处理时间的加长而增加.50.0,100.0µL/L处理组在120h时核酸含量和蛋白质含量增加的幅度较两个低浓度组较小,但较之前仍在增加,且核酸和蛋白质含量在各组间的差异基本上都已经达到了显著性差异(P<0.05).电导率变化趋势与OD260、OD280的变化趋势基本相似.这些参数变化的可能原因是乳酸损伤了铜绿微囊藻的藻细胞膜,使得细胞膜的通透性发生了改变,细胞中的核酸和蛋白质发生外渗,从而OD260、OD280的值增大;细胞内小分子物质外渗,从而电导率升高.

图1　乳酸对铜绿微囊藻藻液电导率的影响Fig.1　The effect of lactic acid on conductivity in the supernatant of M.aeruginosa不同小写字母表示组间比较P<0.05;不同大写字母表示组间比较P<0.01

图2　乳酸对铜绿微囊藻MDA含量的影响Fig.2　The effect of lactic acid on MDA contents of M.aeruginosa不同小写字母表示组间比较P<0.05;不同大写字母表示组间比较P<0.01

2.2.2 乳酸对铜绿微囊藻MDA含量的影响 从图2可以看出,对照组的MDA含量基本保持不变,而实验组MDA含量随乳酸浓度的增加而上升,随着处理时间的加长而增高.同时可以看出,各个浓度组之间的差异也比较显著(P< 0.05),个别组之间的差异甚至达到了极显著性(P<0.01). MDA含量的这种变化可能是因为在乳酸的胁迫作用下,铜绿微囊藻细胞膜脂质过氧化程度加剧,造成了MDA的积累.

含量在逐渐增加,72h时,各浓度组之间的差异基本上都表现为极显著性差异(P<0.01).表明藻细胞受到乳酸胁迫后细胞膜脂质过氧化增加,导致细胞内含量上升,这与MDA含量上升是一致的.

图3　乳酸对铜绿微囊藻O2•含量的影响Fig.3　The effect of lactic acid on O2• contents of M.aeruginosa不同小写字母表示组间比较P<0.05;不同大写字母表示组间比较P<0.01

2.2.4 乳酸对铜绿微囊藻SOD活性的影响 由图4可知,对照组铜绿微囊藻细胞内的SOD活性基本保持不变,而实验组中,随着乳酸浓度的增加,铜绿微囊藻细胞内的SOD活性均呈下降的趋势.最大浓度组(100.0µL/L)在24h时就已经表现出SOD总活性相对于对照组有较大的下降幅度,而其它几个较低浓度组此时的SOD总活性相对于对照组还未显示出较大差异,但随着时间的延长,其活性也逐渐低于对照组.当藻细胞受到乳酸胁迫时,细胞内氧自由基浓度上升,而SOD具有清除细胞内自由基的作用,抗氧化体系酶活性理应也会随之上升,而本实验中SOD活性下降的可能原因是乳酸对藻细胞的协迫作用比较强烈,大多数藻细胞还来不及产生相应的生理应对措施就已经死亡(这与乳酸对铜绿微囊藻抑制率大小的影响结果2.1相吻合),导致总的蛋白质合成量减少,抗氧化酶系统的总活性降低,故呈现下降趋势.

图4　乳酸对铜绿微囊藻SOD活性的影响Fig.4　The effect of lactic acid on SOD activity of M.aeruginosa

图5　乳酸对铜绿微囊藻细胞结构的影响Fig.5　The effect of lactic acid on cell structure of M.aeruginosaa为对照组,b、c、d、e依次为乳酸12.5,25.0,50.0,100.0µL/L浓度组

2.2.5 乳酸对铜绿微囊超微结构的影响 由图5可看出乳酸对铜绿微囊藻细胞超微结构破坏明显,图5a是对照组,其细胞壁完整,胶质鞘厚,类囊体清晰,排列整齐;而图5b类囊体开始弯曲,排列不整齐,胶质鞘消失,但整个细胞形态完整,未出现伪空泡;图5c藻细胞破坏进一步加剧,类囊体分散,细胞内出现大的伪空泡;图5d和图5e细胞内部结构混乱,结构破坏,细胞不完整.可见随着乳酸用量的加大,在作用相同时间内,细胞破坏程度明显加重.

2.3 讨论

利用植物的化感作用进行抑藻已是环境领域研究者的共识,而植物化感抑藻的原理主要是植物分泌释放的一些化感物质在起作用.植物产生的化感物质,主要是一些次生代谢产物,它的种类很多,其中相当一部分已被分离鉴定,主要有脂肪酸、有机酸、萜类及酚类物质[11-13]等.不少化感物质和相关机理已被研究[14-16].乳酸也被证实为某些植物,如金鱼藻[6],所分泌的化感物质之一,并且他有着优于其他大多数化感物质所不具备的物理性质.

植物化感物质抑藻的机理往往根据化感物质种类的不同而不同[17],且往往同一种物质作用的机理不止一种,而是多种方式共同起作用的.如化感物质可以使叶绿素a的含量减少[18],破环藻的光合系统;破环细胞膜的结构[19],导致膜的完整性丧失;影响细胞内酶的活性[20],从而使其正常生理功能改变;破环细胞的超微结构[19]以及影响细胞内基因的表达[21]等.

本实验中乳酸的抑藻结果表明,较低浓度时的乳酸即可抑制铜绿微囊藻的生长,抑藻效果明显.乳酸抑藻部分机理方面的研究显示,OD260、OD280、电导率的值随着乳酸浓度的增加而增大,说明藻细胞内核酸、蛋白质和小分子物质外渗,表明藻细胞膜在乳酸作用下通透性发生了改变;和MDA随着乳酸浓度的增加而增大,揭示出乳酸使铜绿微囊藻细胞膜脂质过氧化程度加剧;SOD活性下降表明藻细胞的抗氧化酶系统的总活性降低,应激能力下降而死亡;透射电镜图片显示,细胞的超微结构发生了明显改变.这些测定结果符合上述的化感物质作用机理中的几种.由此推测乳酸可能的抑藻机理是改变了藻细胞膜的通透性及其细胞内部结构,降低了其抗氧化能力,最终使得藻细胞裂解死亡.由于本实验只研究了乳酸可能的抑藻机理中的一部分,那么乳酸抑藻是否同时还存在其它的机制呢?比如上述机制中对基因表达的影响,对光和系统的破坏?这仍需进一步的研究与探索.

乳酸作为植物的化感物质之一,对生态有着较好的安全性[22],且使用起来较方便,可以直接喷洒乳酸进入污染水体进行铜绿微囊藻的清除.该成果可为富营养化水体蓝藻水华治理和抑藻剂的开发提供有力材料和有用参考.

3　结论

3.1 乳酸对铜绿微囊藻的生长有很强的抑制作用,且抑制效果与乳酸浓度成正相关.

3.2 乳酸可能的抑藻机理是改变了藻细胞膜的通透性及其细胞内部结构,降低了其抗氧化能力,最终使得藻细胞裂解死亡.

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The inhibitory effect of lactic acid on Microcystis aeruginosa and its mechanisms.

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Abstract：The inhibitory effect and possible inhibitory mechanisms of lactic acid on M. aeruginosa were studied. The results showed that lactic acid had a strong inhibiting effect on the growth of M. aeruginosa, 72h, except the inhibition rate of experimental group in lowest concentration was 60%, the rest inhibition rate of experimental group were reached more than 80%; under the stress of lactic acid, the contents of nucleic acid and protein, the electrical conductivity (EC) in M. aeruginosa supernatant all increased, the contents of malondialdehyde (MDA) and oxygen free radical (O2•) of M. aeruginosa cells enhanced, the activity of superoxide dismutase (SOD) decreased, and transmission electron microscope photographs showed that ultrastructure of M. aeruginosa cells had changed obviously. All the results indicated that the possible inhibiting mechanisms were that lactic acid changed the permeability of M. aeruginosa membrane and the cell structure, decreased its antioxidant capacity, and caused the crack and death of the cell in the end.

Key words：lactic acid；Microcystis aeruginosa；inhibitory effect；inhibitory mechanism

作者简介：彭桂莹(1990-),女,安徽东至人,硕士研究生,主要研究方向为水域生态学.

基金项目：国家自然科学基金资助项目(31170443)

收稿日期：2015-09-10

中图分类号：X503

文献标识码：A

文章编号：1000-6923(2016)04-1167-06