鸡白细胞介素18基因的克隆与原核表达

宋佰芬　李晓婷　崔玉东

摘 要：白介素18（IL-18）最早被称为干扰素诱导因子（interferon-γ-inducing factor，IGIF），是近年发现的一种重要的免疫调节因子。该实验根据GenBank中已公布的鸡IL-18的基因序列，设计并合成了一对特异性引物，应用RT-PCR方法扩增出IL-18基因，并将该基因克隆到pMD18-T载体中，经过质粒酶切、PCR和测序鉴定，阳性克隆命名为ChpMD18-T-IL-18。将ChpMD18-T-IL-18双酶切后与pET32a表达载体连接，转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，经IPTG诱导表达鸡IL-18蛋白，结果表明，在28kD左右出现了目的条带，经western blot检测确定该蛋白获得高效表达，为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。

关键词：鸡；白细胞介素18；原核表达

中图分类号 Q786 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）17-0019-03

Abstract：Interleukin 18（IL-18）is called interferon gamma inducing factor（IGIF）.It is a kind of important immune adjustment factor.In this paper，a pair of specific primer was designed and synthesised according to IL-18 DNA sequence in GenBank，IL-18 gene was amplified by RT-PCR method and was inserted into pMD18-T vector.Positive plasmids were identified by PCR and restriction enzyme digestion methods.Then IL-18 gene was inserted into pET32a vector.Positive plasmids were identified by PCR and restriction enzyme digestion methods and were transformed into escherichia coli competent cells.Recombinant E.coli were induced by IPTG and IL-18 protein was detected by SDS-PAGE and Western blot methods.The results showed IL-18 protein was expressed.This would establish a basis for studying the function of this protein.

Key words：Chicken；Interleukin 18；Prokaryotic expression

白介素18（Interleukin-18，IL-18）又名IFN-γ诱导因子（Interferon-γ Inducing Factor，IGIF），是由激活的单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞产生的一种多功能细胞因子[1]。IL-18具有多种生物学功能[2-4]，能够诱导NK、NKT、Th1细胞产生IFN-γ、lL-2、TNF-α和GM-CSF等细胞因子，增强CTL细胞和NK细胞的活性，促进T细胞的增殖，增强Th1型细胞的免疫，在抗肿瘤、抗感染等方面具有广阔的临床应用前景[5-7]。

唐梦君等将传染性支气管炎病毒的M基因与禽源的白介素18基因共同表达，结果表明二者相互作用可以增强鸡体对DNA疫苗的免疫应答，提高对IBV强毒的抵抗力[8]。何静等将IFN-α和鸡白介素18进行了融合表达，结果显示IL-18增强了IFN-α抗病毒活性[9]。以上研究显示了IL-18的免疫增强效果。但作为IFN-γ的诱生剂，在IFN-γ抗病毒和免疫调节的过程中它是否也能起到同样的增强效果，则未见相关的报道。为此，本研究将对该基因进行了原核表达，以期为其功能的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒 E.coil.DH5α和BL21菌株由黑龙江八一农垦大学细胞生物学实验室保存。克隆载体pMD18-T购自宝生物工程大连有限公司。表达载体是pET32a由黑龙江八一农垦大学细胞生物学实验室保存。

1.2 工具酶和试剂 Rocket ScriptTMRT PreMix反转录试剂盒、RNA抽提Trizol试剂盒、RPMI RPMI1640培养液、Hanks液等购自Gibco公司，限制性内切酶Fast Digest BamHI、Fast Digest HindⅢ、T4DNA连接酶、dNTP、DNA Polymerase High Fidelity（HiFi）购自Transgen公司。LPS购自上海生物工程技术服务有限公司。

1.3 引物设计 根据GenBank登陆的ChIL-18

（gb|AY775780.1|）基因序列设计上游和下游引物F1、R1，上游引入酶切位点BamHⅠ，下游引入酶切位点HindⅢ。

1.4 鸡脾淋巴细胞的制备 无菌分离30日龄鸡新鲜脾脏，置于盛有Hank's液（含有10%的牛血清和5%的双抗）的平皿中。用无菌注射器芯将脾脏挤压通过尼龙膜，300g离心10min洗涤两次，再以RPMI 1640培养液洗涤一次，用来去除红细胞的影响。用倍比稀释技术稀释成5×107个·mL-1，24孔板培养。

1.5 鸡IL-18的诱导及RNA的提取 将上述鸡脾淋巴细胞培养12h后，加入浓度为10μg·mL-1的LPS刺激10h[9]。收获细胞后。进行总RNA提取，提取方法参照反转录试剂盒说明书进行。

1.6 鸡IL-18基因的克隆与测序 将上述获得的cDNA进行PCR扩增，PCR的反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸10min。PCR产物经纯化后与pMD18-T载体连接过夜，连接产物转化到E.coil DH5α的感受态细胞中。并涂布于含有氨苄的抗性平板上，过夜培养。挑单菌落接种到含氨苄抗性的LB培养液中，37℃，180r转震荡培养过夜。提取质粒进行PCR和双酶切鉴定。

1.7 鸡IL-18原核表达载体的构建以及重组蛋白的表达 将测序正确的ChpMD18T-IL18进行双酶切，并与同样双酶切的pET32a载体进行连接，转化大肠杆菌BL21感受态细胞后，涂布汗氨苄的抗性平板进行筛选。阳性菌落再进一步提取质粒进行双酶切和PCR鉴定。阳性质粒命名为pET32a-IL18。阳性菌液用IPTG进行诱导表达，SDS-PAGE及Western blot进行检测[10]。

2 结果与分析

2.1 鸡IL-18基因RT-PCR结果 鸡脾细胞用LPS诱导后，提取总RNA，反转录后进行RT-PCR，并进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示在597bp左右处出现了一目的条带，与预期相符，结果如图1。

2.2 鸡IL-18克隆载体的鉴定结果 鸡IL-18PCR产物纯化后，连接到pMD18-T载体中，转化大肠杆菌后提取质粒进行酶切鉴定，结果切出597bp目的条带和2 980bp载体条带，与预计相符，结果见图2。

2.3 鸡IL-18原核表达载体的鉴定结果 将鸡IL-18基因连接到原核表达载体pET32a中，并转化到大肠杆菌中，提取质粒后进行酶切鉴定，结果切出载体和目的两条条带，与预期相符，结果见图3。

2.4 鸡IL-18基因表达结果 构建好的重组菌经IPTG诱导表达后，进行SDS-PAGE分析，结果在28kD处出现目的条带，大小与预计相符，结果见图4。

2.5 鸡IL-18 Western blot结果 将SDS-PAGE电泳凝胶转移到硝酸纤维素膜上，经抗His-tag一抗、HRP标记的羊抗鼠IgG二抗反应，最后以DAB显色，结果在28kD处检测到表达的蛋白质条带，结果见图5。

3 讨论与结论

IL-18能诱导机体产生干扰素-γ等细胞因子，而且还具有佐剂的作用，能显著增强其他疫苗的免疫效果，而干扰素-γ具有广谱的抗病毒效果。Kim等[11]构建了pOVA/IL18、pOVA、pIL18真核表达质粒，将以上质粒分别或共同肌注免疫小鼠后，检测pOVA特异性IgG2a和IFN-γ的分泌，结果发现pOVA/IL18组免疫效果较pOVA组显著升高，表明IL-18能增强Th1型免疫应答。Mar shall等[12]将PSADNA疫苗与IL-18质粒共同注射小鼠后，发现IL-18能显著提高CD4+、CD8+ T淋巴细胞应答和抗原特异性免疫应答及疫苗效能。Billaut等[13]研究发现，IL-18DNA质粒与表达HIV-1 Gag，Tat和Nef蛋白的多价DNA疫苗共免疫，可缩短CTL诱导时间2周，增加抗原诱导的IL-2和IFN-γ的分泌，增强抗原特异性Th细胞的增殖，而降低抗HIV抗体滴度。

本研究将IL-18连接到pET32a表达载体中进行诱导表达，结果在28kD处出现目的条带，经活性分析该蛋白具有生物活性，这为进一步研究该蛋白和IFN-γ共同抗病毒机制的研究奠定了一定的基础。

参考文献

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