亚低温联合载神经干细胞的纤维蛋白支架对颅脑创伤的修复作用

廖余平，陈翀，李晓红，王景景，陈以胜，张赛，孙洪涛△



亚低温联合载神经干细胞的纤维蛋白支架对颅脑创伤的修复作用

廖余平1,2，陈翀1，李晓红1，王景景1，陈以胜1，张赛1，孙洪涛1△

摘要：目的研究大鼠颅脑创伤（TBI）后原位移植神经干细胞（NSCs）治疗的可能性，探讨载有NSCs的纤维蛋白支架及与亚低温（MHT）联合对TBI的治疗作用。方法从孕14 d SD大鼠皮质组织中分离NSCs，与纤维蛋白支架共培养，应用扫描电镜观察支架及NSCs的形态，并通过免疫荧光检测细胞类型。将48只雄性SD大鼠随机分成TBI组（A组）、TBI+NSC组（B组）、TBI+MHT组（C组）、TBI+NSC+MHT组（D组），每组12只。A组通过液压损伤仪行TBI造模；B组TBI后接受NSCs移植治疗；C组TBI后接受MHT治疗；D组TBI后接受NSCs与MHT联合治疗。分别在第14、28天通过神经功能缺陷评分（mNSS）和水迷宫实验对大鼠进行神经功能评价；28 d后取脑组织切片，行细胞免疫荧光检测，观察移植后的NSCs在体内分化情况。结果电镜扫描显示，NSCs与纤维蛋白支架共培养3 d后形态无明显改变；免疫荧光提示NSCs特异性标志物Nestin阳性表达，表明神经干细胞在纤维蛋白支架上存活；D组大鼠的mNSS在第14天和第28天均低于A、B、C各组；水迷宫结果显示，D组大鼠逃避潜伏期短于A、B、C各组；D组28 d后脑组织取材可追踪到BrdU标记的神经干细胞分化为了神经元。结论纤维蛋白支架与NSCs生物相容性良好，具有可降解性。亚低温与载NSCs的纤维蛋白支架对大鼠TBI后的神经功能修复具有协同作用。

关键词：颅脑损伤；神经干细胞；纤维蛋白支架；亚低温

△通讯作者E-mail：chenmo333@163.com

大量的基础和临床研究表明，神经干细胞（neu⁃ral stem cells，NSCs）移植治疗颅脑创伤（traumatic brain injury，TBI）的效果不够理想，其原因主要与NSCs的低存活率有关[1]。移植干细胞的大量死亡主要与TBI局部缺血、缺氧、炎症、水肿的微环境有关[2]。移植干细胞在目标部位存活是干细胞发挥作用的前提，而影响干细胞行为的决定性因素主要是局部的微环境。前期的研究通过皮质损伤后直接局部移植NSCs发现，移植细胞黏附、迁移到损伤区的比例非常低[3-4]，主要是缺乏支撑移植细胞存活的三维细胞外基质结构，细胞移植后大部分被迁移丢失。本实验采用纤维蛋白支架模拟细胞外基质结构，联合亚低温治疗（mild hypothermia treatment，MHT）对TBI大鼠进行干预，探讨其对TBI的治疗效果。

1　材料与方法

1.1材料孕14 d SD大鼠胎鼠和清洁级260～300 g SD大鼠（购自解放军军事医学科学院）；纤维蛋白原、凝血酶、抑肽酶（Sigma，美国）；B27、成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、BrdU（Sigma，美国）；DMEM培养基（Gibco，美国）；小鼠抗BrdU抗体（Abcam，英国）；兔抗NeuN抗体、FITC标记的山羊抗小鼠IgG二抗、FITC标记的山羊抗兔IgG二抗（Life technology，美国）。

1.2方法

1.2.1NSCs分离与培养孕14 d的SD大鼠胎鼠采用6%水合氯醛（36 mg/kg）进行腹腔麻醉，75%乙醇全身消毒，剖腹取胎鼠，取脑，剪碎吹打，加入全培养基[DMEM/F12、20 μg/L EGF、20 μg/L bFGF、1% N2（N-2supplement），2% B274mmol/L谷氨酰胺]，于37℃、5%CO2培养箱中培养。培养3～ 4 d离心、弃去上清液，5～7 d后用吸管吹打NSCs球（即形成的细胞克隆）制成单细胞悬液后继续传代。用10 μmol/L的BrdU标记48 h备用。

1.2.2纤维蛋白支架的制备将纤维蛋白原溶解在生理盐水中，配制成40 g/L的纤维蛋白原溶液（含50 U/mL的抑肽酶）。将凝血酶溶解在40 mmol/L CaCl2溶液中，配制浓度为40 U/mL的凝血酶溶液。将纤维蛋白溶液和凝血酶溶液等体积混合后，置入37℃恒温箱中，充分孵育10 min，待纤维蛋白完全凝胶后，检测其性能。

1.2.3纤维蛋白支架的微观结构将制备的纤维蛋白凝胶样品采用乙醇溶液进行脱水，加入丙酮和醋酸异戊酯进行置换，最后采用CO2临界点干燥法进行干燥后喷金，在扫描电镜下观察纤维蛋白支架的形态。

1.2.4纤维蛋白支架与NSCs的生物相容性1×106个NSCs种植于上述制备的纤维蛋白支架上，隔天半量换液。扫描电镜标本制备，48 h、96 h后分别以2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脱水，临界点冷冻干燥，喷金，扫描电镜观察细胞的形态和分布。免疫荧光标本制备，72 h后用4%多聚甲醛固定，10µm冰冻切片，行Nestin免疫荧光染色，观察细胞在支架内的生长情况。

1.2.5重型脑损伤模型的制作将SD大鼠（n=48）采用抽签法随机分成4组，每组12只。TBI组（A组）大鼠行颅脑液压冲击损伤；TBI+NSC组（B组）经颅脑液压冲击损伤后给予NSC混合支架治疗；TBI+MHT组（C组）经颅脑液压冲击损伤后给予亚低温治疗；TBI+NSC+MHT组（D组）颅脑液压冲击损伤后给予NSC混合支架及亚低温治疗。称质量，6%水合氯醛（36 mg/kg）麻醉，固定于立体定向仪，头皮正中切开，暴露颅骨，以前囟后3.8 mm、中线右侧2.5 mm为中心，开直径4.0 mm圆形骨窗；用增强型牙科磷酸锌水门汀将打击管固定于颅骨上，在管内充满生理盐水；连接液压冲击脑损伤仪的打击口，调整冲击压为243.18 kPa，平均时程为20 ms。TBI之后、骨蜡止血，大鼠于温暖、增氧恢复室、含食物及水的环境下进行饲养。

1.2.6NSCs移植TBI后即刻行混合支架移植，溶解在40 g/L纤维蛋白原中的1×106个NSCs，与溶解在40 mmol/L Ca⁃Cl2的40 U/mL凝血酶等体积混合（含抑肽酶50 U/mL）,移植入损伤近缘，分4个位点注射，每个位点5 μL。

1.2.7亚低温联合治疗在进行细胞移植后即刻接受亚低温治疗。用小动物亚低温治疗仪在30 min内将全身降温至肛温33℃，维持6 h，然后复温至37℃，复温速度为0.4℃/h。

1.2.8神经功能缺陷评分与Morris水迷宫实验TBI后0、14、28 d分别行单盲神经运动功能检测。在移植后第14天及第28天通过神经功能缺陷评分（modified neurological se⁃verity score，mNSS）进行单盲神经功能评分。评分由运动（肌张力、异常活动）、感觉（视觉、触觉、本体感觉）、反射、平衡试验组成，评分在0～18分，正常为0分，最大神经功能缺失为18分。Morris水迷宫实验测试大鼠的学习记忆能力，大鼠TBI前3 d连续进行水迷宫训练，TBI后记录大鼠从入水到找到平台所用时间，即逃避潜伏期。

1.3统计学方法采用SPSS 19.0进行统计处理。计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1纤维蛋白支架与NSCs的生物相容性对凝固后的纤维蛋白支架及混合支架行扫描电镜观察，单纯纤维蛋白支架在扫描电镜下的孔隙结构，见图1a；共培养支架孔隙之间有细胞形态，与支架黏附紧密，见图1b。共培养支架免疫荧光结果显示，Nestin呈持续阳性表达，见图2。共培养支架免疫荧光以及扫描电镜观察提示，纤维蛋白支架是构建可降解、生物相容性好的三维支架材料，能为NSCs提供适宜的细胞外基质，起到暂时固定NSCs的作用。

Fig.1 Observation of fibrin scaffold and mixed fibrin scaffold by SEM图1　纤维蛋白支架与混合支架的扫描电镜观察

2.2NSCs存活情况结果显示，D组移植的NSCs能够存活，并分化为神经元，见图3。

2.3NSCs移植与亚低温对TBI大鼠mNSS的影响TBI后14 d及28 d，B组或C组处理与A组相比都能促进mNSS的降低（P < 0.05）；D组的mNSS低于B、C和A组（P < 0.01）；B组与C组mNSS比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

Tab. 1 Comparison of mNSS score after TBI between four groups表1　TBI后各组mNSS评分比较（n=12，分，±s）

Tab. 1 Comparison of mNSS score after TBI between four groups表1　TBI后各组mNSS评分比较（n=12，分，±s）

＊＊P < 0.01；a与A组比较，b与B组比较，c与C组比较，P < 0.05；表2同

组别A组B组C组D组F TBI后14 d 5.42±1.44 4.17±1.03a4.25±1.22a2.75±1.06abc9.973＊＊TBI后28 d 3.75±0.87 2.83±0.94a2.92±0.90a1.42±0.90abc13.838＊＊

2.4NSCs与亚低温对TBI大鼠逃避潜伏期的影响TBI后14 d及28 d，B组或C组与A组相比都能促进逃避潜伏期的缩短（P < 0.05）；D组的逃避潜伏期低于B、C和A组（P < 0.01）；B组与C组逃避潜伏期差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

Tab. 2 Comparison of escape latency after TBI between four groups表2　各组Morris水迷宫试验逃避潜伏期比较（n=12，s，±s）

Tab. 2 Comparison of escape latency after TBI between four groups表2　各组Morris水迷宫试验逃避潜伏期比较（n=12，s，±s）

组别A组B组C组D组F TBI后14 d 73.00±16.87 55.92±13.64a58.75±21.51a44.75±17.01abc8.473＊＊TBI后28 d 63.25±16.41 49.75±12.14a48.83±16.43a33.83±11.51abc7.878＊＊

3　讨论

笔者前期的研究通过皮质损伤后直接局部移植NSCs发现，移植细胞黏附、迁移到损伤区的比例非常低，很大部分原因是缺乏支撑移植细胞存活的三维的细胞外基质结构，细胞移植后大部分随体液丢失[5]。Karlsson等[1]研究发现，当移植组织植入大鼠后保持亚低温（32～33℃）能改善移植物的存活。联合亚低温治疗被广泛用于TBI治疗研究[6-7]。亚低温对TBI的神经保护作用强调在TBI后的早期应用[8]，本实验TBI后的即刻将实验大鼠进行亚低温治疗。实验鼠与NSCs来源为同种系，基因型相同，NSCs移植到大鼠体内后不产生免疫排斥反应，因此，实验过程没有应用免疫抑制药物。本次研究首次采用载有NSCs的纤维蛋白支架用于TBI的局部治疗，采用液压损伤仪行TBI造模，清除血肿后局部注射混合支架。研究发现与A组相比，B、C、D组的神经功能与认知能力得到改善。D组能够追踪到BrdU标记的NSCs。进一步的分析发现，当纤维蛋白混合支架联合亚低温治疗时具有最大的保护作用。本研究结果显示亚低温能促进移植NSCs的存活，亚低温与干细胞对大鼠神经功能的保护优于其各自的单独作用。

3.1亚低温对急性颅脑创伤的神经保护作用低温状态下脑代谢下降，脑组织对氧气及葡萄糖的消耗减少，使脑组织易于维持氧的供需平衡，并可以减少和抑制氧自由基及兴奋性神经递质的生成与释放[9]，亚低温还可以通过抑制某些炎性介质（如花生四烯酸等）的生成及释放[10]，改善脑缺血后血脑屏障的通透性，从而可以减轻血脑屏障的破坏和血管源性脑水肿的发生，改善微环境，一方面起到神经保护作用，另一方面可能起到促进移植NSCs存活的作用。

3.2纤维蛋白支架的优点在组织工程技术领域，三维的支架结构用于调节以及引导细胞生长并促进组织再生，支架需具有良好生物相容性、能进行生物降解、促进细胞以及生物材料相互作用。一些天然的生物材料如纤维蛋白支架能为宿主提供一个类似的细胞外基质结构。自体纤维蛋白支架因其低纤维蛋白原浓度、不引起炎症反应，更适合细胞的生长[11]。采用纤维蛋白支架模拟NSCs的细胞外基质结构，能为移植NSCs提供一暂时的立体生长环境，防止其随体液丢失。

3.3神经干细胞的作用机制研究表明，NSCs移植保护神经系统免受炎症损伤通过多重机制，不单是直接的细胞替代，NSCs能到达靶器官，并分化成合适的细胞系[12]。移植细胞可能在解剖上重建损伤的大脑，移植细胞与宿主细胞形成突触连接，外生的细胞进入颅内可以产生神经营养因子和生长因子，移植细胞可以促进内源性细胞产生神经营养因子和生长因子。内源性细胞和外源性细胞是动态变化的，对微环境都非常敏感，外源性细胞具有向损伤处迁移的特性[13]。

亚低温对TBI具有神经保护作用，细胞移植也广泛用于中枢神经损伤的修复研究，本研究将亚低温与神经干细胞联合，发现亚低温能促进移植NSCs的存活，两者联合对神经功能的修复具有协同作用，但其协同的机制以及潜在的应用价值有待进一步研究。

（图2、3见插页）

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（2015-05-05收稿2015-09-25修回）

（本文编辑李鹏）

作者单位：1脑创伤与神经疾病研究所，武警后勤学院附属医院脑科医院，天津市神经创伤修复重点实验室（邮编300162）；2辽宁医学院，武警后勤学院附属医院研究生培养基地

Experimental study of combination of mild hypothermia and fibrin scaffold carrying neural stem cells on repairing traumatic brain injury

LIAO Yuping1，2, CHEN Chong1, LI Xiaohong1, WANG Jingjing1, CHEN Yisheng1, ZHANG Sai1, SUN Hongtao1△
1 Institute of Traumatic Brain Injury and Neurology, Brain Hospital of Affiliated Hospital of Logistics College of Chinese People′s Armed Police Forces, Tianjin Key Labrotary of Neurotrauma Repair, Tianjin 300162, China;
2 Liaoning Medical University, Postgraduate Training Base of Affiliated Hospital of the Logistics University of CAPF
△Corresponding Author E-mail：chenmo333@163.com

Abstract：Objective To investigate the possibility of therapy method in orthotropic transplant fibrin scaffold mixedbook=182,ebook=59neural stem cells (NSCs) after traumatic brain injury (TBI), and combined effects of that fibrin scaffold with mild hypothermia (MHT) on TBI in rats. Methods Neural stem cells were separated from E14 Sprague-Dawley rats, and were co-cultured with fibrin scaffold. Scanning electron microscope was used for observing neural stem cell surface morphology in fibrin scaf⁃fold, and immunofluorescent staining was introduced for detecting cell types. Forty-eight male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: TBI group (A), TBI+NSC group (B), TBI+MHT group (C) and TBI+NSC+MHT group (D). TBI model was built with fluid percussion device in group A. Group B was treated with fibrin scaffold carrying neural stem cells after TBI. Group C was treated with MHT for 6 hours after TBI. Fibrin scaffold mixed BrdU labeled neural stem cells were co-transplanted into cortex damage area of group D and mild hypothermia was given for 6 hours. mNSS (modified neuro⁃logical severity score) and Morris water maze were examined to evaluate the neurologic function at 14 and 28 days after TBI. The rats were sacrificed at 28 days for brain slices. Immunofluorescent staining was used to examine the migration and differ⁃ention of NSCs in vivo. Results No obvious morphology changes were observed in NSCs, which were co-cultured in fibrin scaffold. The specific marker Nestin was expressed in detected NSCs by immunofluorescence, which indicated that NSCs were still alive in the co-coture fibrin scaffold. The mNSS scores were significantly lower in group D than those of groupA, B and C at day-14 and day-28 (P < 0.05). Results of Morris water maze showed that the escape latency was significantly short⁃er in group D than that of group A, B and C (P < 0.05). BrdU labled NSCs was found differentiated into neurons in group D at day 28. ConclusionFibrin scaffold and NSCs have a good biocompatibility and biodegradablity. MHT and fibrin scaffold jointed NSCs improve neurologic function in rat TBI model with the synergistic reaction.

Key words：traumatic brain injury；neural stem cells；fibrin scaffold；mildhypothermia

中图分类号：R651.15

文献标志码：A

DOI：10.11958/58859

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81471275，81341113，81271392，81401067）；天津市应用基础与前沿技术研究计划项目（14JCQN⁃JC10200）

作者简介：廖余平（1989），男，硕士研究生，主要从事中枢神经创伤修复研究