Ⅳ期维吾尔族NSCLC患者EML4-ALK、EGFR基因突变状态及生存分析

王强，张峤，曹燕珍，陶洁，单莉△



Ⅳ期维吾尔族NSCLC患者EML4-ALK、EGFR基因突变状态及生存分析

王强1，张峤1，曹燕珍2，陶洁1，单莉1△

摘要：目的探讨棘皮动物微管样蛋白4-间变淋巴瘤激酶（EML4-ALK）和表皮生长因子受体（EGFR）基因突变状态与未经系统酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）治疗的Ⅳ期维吾尔族非小细胞肺癌（NSCLC）患者长期生存的关系。方法收集97例未经TKIs治疗的Ⅳ期维吾尔族NSCLC患者的组织标本，分别运用FISH及ARMS方法检测EML4-ALK基因融合及EGFR基因突变状态并进行生存分析。结果97例Ⅳ期维吾尔族NSCLC组织中，6例（6.2%）存在EML4-ALK基因融合，26例（26.8%）存在EGFR基因突变。生存分析显示，EML4-ALK基因融合患者与EML4-ALK基因未融合患者总生存期（OS）差异无统计学意义（P=0.941），EGFR基因突变患者与EGFR野生型患者OS比较差异无统计学意义（P=0.607）。EGFR/EML4-ALK综合突变对Ⅳ期维吾尔族NSCLC患者长期生存发现，EGFR突变型组、EML4-ALK阳性组、EML4-ALK阴性+EGFR野生型组患者中位OS分别为17.7、17.3、16.2个月，差异无统计学意义（P=0.915）。结论在排除TKIs治疗影响的情况下，EML4-ALK融合基因与EGFR基因突变状态尚不能作为评估Ⅳ期维吾尔族NSCLC患者预后的独立因素。

关键词:癌,非小细胞肺；受体,表皮生长因子；突变；维吾尔族；非小细胞肺癌；棘皮动物微管样蛋白4-间变淋巴瘤激酶；生存分析

△通讯作者E-mail：shanlinew319@163.com

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，而其中80%以上为非小细胞肺癌（NSCLC）[1]。随着分子遗传学研究的不断进展，NSCLC被细分为各种不同的分子亚型，并由此研发了各类分子靶向治疗药物。已有多项研究表明，对于初发表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor,EGFR）敏感突变的NSCLC患者，应用EGFR-酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）治疗在疾病控制率（objective response rate,ORR）、无进展生存期（progress free survival,PFS）和生活质量上均优于化疗[2-3]。但另有研究认为排除使用EGFR-TKIs靶向治疗的NSCLC患者后，EGFR基因突变并不影响其预后[4]。棘皮动物微管样蛋白4-间变淋巴瘤激酶（echinoderm microtubule associated protein like 4-an⁃aplastic lymphoma kinase，EML4-ALK）是新发现的肺腺癌驱动基因。临床试验均证实EML4-ALK阳性肺癌患者对小分子ALK抑制剂均高度敏感，但EML4-ALK对晚期NSCLC患者的预后预测价值存在争议[5- 6]。目前关于维吾尔族NSCLC患者与EML4-ALK基因融合及EGFR基因突变的研究鲜见报道。本研究对Ⅳ期维吾尔族NSCLC肿瘤组织EML4-ALK融合基因与EGFR基因突变状态进行检测，并分析患者的预后，以期为维吾尔族NSCLC患者的个体化治疗、预后判断提供依据。

1　资料与方法

1.1一般资料2005年9月—2012年11月就诊于新疆医科大学附属肿瘤医院肺内科一病区经病理组织学确诊的Ⅳ期维吾尔族NSCLC患者，均有足够的组织学标本行EGFR 及EML4-ALK基因检测，且所有入组的患者均未行TKIs靶向治疗。根据入组标准选取97例，其中女40例（41.2%），男57例（58.8%）；年龄30～77岁，中位年龄59岁；有吸烟史56例（57.7%）；鳞癌24例（24.7%），腺癌73例（75.3%）。

1.2方法

1.2.1EML4-ALK基因的FISH检测使用ALK双色分离探针试剂盒（Vysis LSI ALK Dual Color, Break Apart Rear⁃rangement Probe, Abbo Molecular），根据试剂盒说明进行操作。石蜡切片通过脱蜡等预处理后，依次进行蛋白酶处理、变性、杂交、细胞核染色。在荧光显微镜下随机读取50个肿瘤细胞，要求肿瘤细胞核轮廓及信号清晰，每个细胞核内至少有1组红、绿信号，如果红绿信号分离（距离2个信号直径）或额外出现单独的红色信号，视为阳性细胞；50个观察细胞中阳性细胞<5个为阴性标本，>25个为阳性标本；如果在5～25个之间则再计数50个细胞，100个细胞内合计阳性细胞数，>15个为阳性标本。

1.2.2EGFR基因检测应用直接测序法或扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system, ARMS,Qiagen Inc, Valencia, CA）检测EGFR基因突变情况。按照试剂说明书进行操作，石蜡切片通过脱蜡等预处理后，依次进行消化、DNA提取及纯化、PCR扩增、测序。将PCR产物纯化后应用ABI 3730XL分析仪进行测序分析。阳性即8联PCR管中A～G管，1个或1个以上突变阳性或弱阳性。阴性即8联PCR管中A～G管，7管突变均为阴性。

1.3随访采用查阅病例资料及电话形式对患者进行随访，随访截止时间为2014年4月30日，生存期从确诊Ⅳ期维吾尔族NSCLC之日起，至死亡日期为止；仍生存者至末次随访时间为止，其生存数据为截尾数据。随访时间为3.4～35个月，中位随访时间为16个月。对于失访或非肿瘤原因导致的死亡以“存活”计，按截尾数据处理。

1.4统计学方法采用SPSS 17.0软件进行分析，率的比较采用Pearson χ2检验，采用Kaplan-Meier方法估计组间生存率和绘制累积生存函数曲线，组间比较使用Log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1EML4-ALK基因融合和EGFR基因突变情况97例样本中6例（6.2%）存在EML4-ALK基因融合，即EML4-ALK基因阳性，91例（93.8%）未检测出EML4-ALK基因融合，即EML4-ALK基因阴性。26例（26.8%）存在EGFR基因突变，其中11例为21外显子L858R点突变，14例为19外显子缺失突变，1例为18外显子G719X基因突变，无20外显子T790M突变。EML4-ALK基因阳性的患者未见同时合并EGFR基因突变。见图1～4。

Fig.1 Dual-color split FISH for NSCLC patients with positive EML4-ALK fusion gene（FISH,×100）图1　EML4-ALK融合基因阳性NSCLC患者的FISH结果（FISH，×100）

Fig.2 Dual-color split FISH for NSCLC patients with negative EML4-ALK fusion gene（FISH，×100）图2　EML4-ALK融合基因阴性NSCLC患者的FISH结果（FISH，×100）

Fig.3 ARMS results of EGFR gene mutations in NSCLC patients图3　EGFR基因突变型NSCLC患者的ARMS结果

Fig.4 ARMS results of EGFR gene wild-type in NSCLC patients图4　EGFR基因野生型NSCLC患者的ARMS结果

2.2EML4-ALK基因融合和EGFR基因突变与患者临床病理特征的关系Ⅳ期维吾尔族NSCLC患者中不同性别、年龄、是否吸烟、不同病理类型患者EML4-ALK基因阳性率差异无统计学意义；女性EGFR基因突变率高于男性，非吸烟者高于吸烟患者，腺癌高于鳞癌（均P<0.05）。见表1。

Tab.1 Relationship between EML4-ALK fusion gene and EGFR gene mutation with clinicopathological characteristics of NSCLC patients表1　EML4-ALK基因融合和EGFR基因突变与NSCLC患者临床病理特征的关系　例（%）

2.3生存分析本研究截至2014年4月30日，共有5例失访，失访率为5.2%，其中包括1例EGFR基因突变，4例既无EGFR基因突变又无EML4-ALK基因融合，其余均有完整随访资料。

2.3.1EML4- ALK基因融合对患者预后的影响EML4-ALK基因阴性患者中位总生存期（over⁃all survival，OS）为16.2（95%CI：14.3～18.2）个月，平均生存期为（14.6±1.8）个月；EML4-ALK基因阳性患者中位OS为17.3（95%CI：9.6～25.0）个月，平均生存期为（16.7±6.3）个月，EML4-ALK基因阳性患者与阴性患者间OS差异无统计学意义（Log-rank χ2= 0.006，P=0.941），见图5。

Fig. 5 The correlation between the EML4-ALK fusion and the survival time in Uygur patients with stageⅣNSCLC图5　EML4-ALK基因融合与Ⅳ期维吾尔族NSCLC患者生存时间的关系

2.3.2EGFR基因突变对患者预后的影响EGFR野生型患者中位OS为15.8（95%CI：13.6～18.0）个月，平均生存期为（14.6±1.1）个月；EGFR基因突变患者中位OS为17.5（95%CI：14.0～21.1）个月，平均生存期为（17.3±1.8）个月，EGFR基因突变患者与EGFR野生型患者OS差异无统计学意义（Log-rank χ2=0.265，P=0.607），见图6。

Fig. 6 The correlation between the EGFR mutations and the survival time in Uygur patients with stageⅣNSCLC图6　EGFR基因突变与Ⅳ期维吾尔族NSCLC患者生存时间的关系

2.3.3EGFR/EML4-ALK综合突变对患者预后的影响考虑EML4-ALK基因阳性对EGFR基因野生型及EGFR突变基因型对EML4-ALK基因阴性的影响，将92例有完整随访资料的患者分为EGFR突变型、EML4-ALK阳性和EML4-ALK阴性+EGFR野生型3组进行生存分析，EGFR突变型组患者中位OS为17.7（95%CI：13.8～21.0）个月，平均生存期为（17.0±2.6）个月；EML4-ALK阳性组患者中位OS为17.3（95%CI：9.6～25.0）个月，平均生存期为（16.7±6.3）个月，EML4-ALK阴性+EGFR野生型组患者中位OS为16.2（95%CI：14.4～18.1）个月；平均生存期为（15.6±1.7）个月，3组间OS差异无统计学意义（Log-rank χ2=0.178，P=0.915），见图7。

Fig. 7 The correlation between EGFR mutation, EML4-ALK fusion, and EML4-ALK negative+EGFR wild-type, and the survival time in patients with NSCLC图7　EGFR基因突变、EML4-ALK基因融合及EML4-ALK阴性+ EGFR野生型与Ⅳ期维吾尔族NSCLC患者生存时间的关系

3　讨论

EGFR的表达能激活下游重要的信号通路，从而导致细胞增殖、存活、转移及血管生成等，因此在关于NSCLC的研究中，EGFR一直是一个热点。相关研究显示，EGFR基因突变在亚裔NSCLC中约占30%～40%，在西方高加索人人群中约占10%[7]。本研究中发现EGFR基因突变率为26.8%，低于亚裔人群而又高于西方人群，可能与不同种族之间突变率存在差异有关，但也有研究表明维吾尔族人群EGFR基因突变率与西方高加索人种突变率相似[8]，与本研究略有出入，可能与入组样本量较小有关。本研究发现在Ⅳ期维吾尔族NSCLC中，女性、腺癌及不吸烟的患者EGFR基因突变较多见，与此前多项研究一致[9-10]。融合蛋白EML4-ALK是通过EML4和ALK两个基因片段倒位融合所表达，这种融合基因能通过PI3K-AKT、MAPK和JAKSTAT途径导致肿瘤的发生。既往研究显示在未经选择的NSCLC患者中EML4-ALK融合基因的发生率约为0.5%～11.6%[11]。本研究中EML4-ALK基因融合发生率处于相关研究报道范围的中间偏高水平，明显高于西方高加索人的0.4%～2.7%[11]，这可能与本研究样本量较小及全部均为Ⅳ期患者有关。有研究表明Ⅲ、Ⅳ期NSCLC患者EML4-ALK基因融合比例明显高于Ⅰ、Ⅱ期患者[12]。另有研究发现EML4-ALK基因融合更容易出现在既往少量或无吸烟史和年轻的患者，其病理类型多为腺癌，以腺泡癌和印戒细胞癌多见，且不会与EGFR和KRAS基因突变同时出现[13]。本研究结果却提示EML4-ALK基因阳性率在不同性别、年龄、是否吸烟、不同病理类型的Ⅳ期维吾尔族NSCLC患者中无明显差异，与上述研究报道有所差异，这可能与不同种族及EML4-ALK基因阳性比例在NSCLC人群中所占比例较低，以至于入组的研究病例数较少有关。本研究同样发现不存在EGFR基因突变合并EML4-ALK基因融合的患者，与上述研究相吻合。

目前已有足够的证据表明EGFR基因突变可作为EGFR-TKIs有效性的预测因子[2-3]，但对生存的影响尚不能明确。为排除NSCLC患者临床分期对预后的影响，本研究均选取Ⅳ期NSCLC患者，同时排除了EGFR-TKIs治疗的影响，使EGFR对预后的影响分析更为直接而准确。EGFR突变基因型与野生基因型患者的中位生存时间差异无统计学意义，因此在Ⅳ期维吾尔族NSCLC中，EGFR基因突变尚不能作为独立的预后影响因素。这与多数报道一致。Ayyoub等[2]针对EGFR、KRAS基因突变与生存的关系进行了一项大规模的生存分析，其结果并未显示出EGFR基因突变的患者生存时间延长。亦有研究发现手术切除的296例Ⅰ～Ⅲ期NSCLC患者中（排除术前术后采用EGFR-TKIs治疗者），发生EGFR突变患者的3年OS优于EGFR野生型患者，可见EGFR突变是良好的预后因子[14]。

自Soda等[15]首次在NSCLC患者中发现新的融合基因EML4-ALK后，大多数研究的重点在于EML4-ALK基因融合与NSCLC患者临床特征的关系，而该基因对维吾尔族人群NSCLC患者长期生存的影响鲜见报道。Shaw[5]、Amanda[16]两位学者在2011、2014年先后报道EML4-ALK融合基因并非NSCLC患者的独立预后因子。上述两项研究中入组的研究对象均为欧洲白种人群，而本研究排除ALK-TKIs影响后EML4-ALK基因阳性与阴性患者OS差异无统计学意义。因此，在Ⅳ期维吾尔族NSCLC患者中，EML4-ALK融合基因突变与否同样不能作为独立的预后影响因素。同时本研究排除了EML4-ALK基因阳性对EGFR基因野生型及EGFR突变基因型对EML4-ALK基因阴性的影响，不论是EGFR突变基因还是EML4-ALK融合基因仍然不能作为判断Ⅳ期维吾尔族NSCLC患者预后的影响因素。但也可能是由于样本量较小，且EML4-ALK融合基因突变率本身较低，使得研究中的EML4-ALK融合基因患者较少，此外2组间确诊后治疗方案及一般情况不尽相同也会对结果造成影响，有待进一步验证。

参考文献

[1] Yu Y,Xu X,Du Z, et al. Non-platinum regimens of gemcitabine plus docetaxel versus platinum- based regimens in first- line treatment of advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis on 9 randomized controlled trials[J].Cancer Chemother Pharmacol,2012, 69(5): 1265-1275.doi: 10.1007/s00280-012-1833-y.

[2] Ayyoub M,Memeo L,Alvarez Z,et al. Assessment of MAGE-A ex⁃pression in resected non-small cell lung cancer in relation to clini⁃copathologic features and mutational status of EGFR and KRAS[J]. Cancer Immunol Res, 2014, 2(10): 943- 948.doi: 10.1158/2326-6066.CIR-13-0211.

[3] Mok TS, Wu YL, Thongprasert S, et al. Modern treatments in ad⁃vanced non-small-cell lung cancer: temporal trends and effect on survival. A French Population-Based Study[J]. N Engl J Med, 2015, 361(10): 947-957.doi: 10.1016/j.cllc.2015.05.001.

[4] Kosaka T, Yatabe Y, Endoh H, et al. Mutations of the epithelial growth factor receptor gene in lung cancer: biological and clinical implications[J]. Cancer Res, 2004, 64(24): 8919-8923.

[5] Shaw AT, Yeap BY, Solomon BJ, et al. Effect of crizotinib on overall survival in patients with advanced non-small-cell lung cancer har⁃bouring ALK gene rearrangement: a retrospective analysis[J]. Lan⁃cet Oncol, 2011, 12(11): 1004-1012.doi: 10.1016/S1470-2045(11) 70232-7.

[6] Wang ZJ, Zhang XC, Bai H, et al. EML4-ALK Rearrangement and its clinical significance in Chinese patients with advanced nonsmall cell lung cancer[J]. Oncology, 2012, 83(3): 248- 256.doi: 10.1159/000341381.

[7] Kris MG, Johoson BE, Kwiatkowaski DJ, et al. Identification of driv⁃er mutations in tumor specimens from 1 000 patients with lung ade⁃nocarcinoma:the NCI′s Lung Cancer Mutation Consortium(LCMC), 2011[C]. ASCO Annual Meeting, 2011.

[8] Zhang Y, Ma L, Shan L. Relationship between mutations of epider⁃mal growth factor receptor gene and clinicopathological features of non-small cell lung cancer in Uygur patients[J]. Journal of Practical Oncology, 2013, 28(5): 469-472.[张琰,马玲,单莉.新疆维吾尔族非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变与临床病理特征的关系[J].实用肿瘤杂志, 2013, 28(5): 469-472].

[9] Heymach JV, Lockwood SJ, Herbst RS, et al. EGFR biomarkers pre⁃dict benefit from vandetanib in combination with docetaxel in a ran⁃domized phase III study of second-line treatment of patients with advanced non-small cell lung cancer[J].Ann Oncol, 2014, 25(10): 1941-1948.doi: 10.1093/annonc/mdu269.

[10] Zhang Q, Dai HH, Dong HY, et al. EGFR mutations and clinical outcomes of chemotherapy for advanced non-small cell lung can⁃cer: A meta-analysis[J]. Lung Cancer, 2014, 85(3): 339-345.doi: 10.1016/j.lungcan.2014.06.011.

[11] Martelli MP, Sozzi G, Hernandez L, et al. EML4-ALK rearrange⁃ment in non-small cell lung cancer and non-tumor lung tissues[J]. Am J Pathol, 2009, 174(2): 661- 670.doi: 10.2353/ajpath.2009. 080755.

[12] Wang M, Yang JY, Li JC, et al. Expression of EML4-ALK in nonsmall cell lung cancer and its clinical significance[J]. Chinese Clini⁃cal Oncology, 2013, 18(8): 688-690.[王梦,杨继元,李军川,等. EML4-ALK在非小细胞肺癌中的表达及临床意义[J].临床肿瘤学杂志, 2013, 18(8): 688-690].

[13] Rodig SJ,Mino KM,Dacic S,et al.Unique clinicopathologic features characterize ALK-rearranged lung adenocarcinoma in the western population[J]. Clin Cancer Res, 2009, 15(16): 5216- 5223.doi: 10.1158/1078-0432.CCR-09-0802.

[14] Sun LW, Ren XB. Efficacy analysis on arterial interventional thera⁃py combined with erlotinib in advanced non-small-cell lung cancer with brain metastasis[J]. Tianjin Med J,2014, 42(3): 271-274. [孙立伟,任秀宝.动脉灌注介入联合厄洛替尼治疗晚期非小细胞肺癌合并脑转移疗效分析[J].天津医药,2014,42(3):271-274].doi: 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.024.

[15] Soda M, Choi YL, Enomoto M, et al. Identification of the transform⁃ing EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer[J]. Na⁃ture, 2007, 448(7153): 545-566.

[16] Amanda LH, Martin E, Fernando G, et al. Preselection based on clinical characteristics in German Non-Small-Cell lung cancer pa⁃tients screened for EML4-ALK Translocation[J]. J Thorac Oncol, 2014, 9: 109-113.doi: 10.1097/JTO.0000000000000043.

（2015-05-08收稿2015-07-07修回）

（本文编辑李国琪）

作者单位：1新疆医科大学附属肿瘤医院肺内科一病区（邮编830011），2病理科

EML4-ALK and EGFR mutation status and survival analysis in Uygur with stageⅣNSCLC

WANG Qiang1，ZHANG Qiao1，CAO Yanzhen2，TAO Jie1，SHAN Li1△
1 Department of Medical Oncology, 2 Department of Pathology, Tumor Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China
△Corresponding Author E-mail：shanlinew319@163.com

Abstract：Objective To investigate the relationship between the echinoderm microtubule associated protein like 4-anaplastic lymphoma kinase (EML4-ALK) and epithelial growth factor receptor (EGFR) mutation status and overall survival (OS) in Uygur patients with stageⅣnon-small cell lung cancer (NSCLC) who did not accept tyrosine kinase inhibitor treat⁃ment. Methods Totally 97 tissue samples were collected from Uygur patients with stageⅣNSCLC who did not accept tyro⁃sine kinase inhibitor treatment. EML4-ALK fusion gene and EGFR mutation status were detected by using FISH and ARMS methods. The survival rates were analysed. Results In 97 tissue samples, EML4-ALK fusion genes were found in 6 (6.2%) samples, EGFR mutations were found in 26 (26.8%) samples. The survival analysis showed that there was no significant dif⁃ference in OS between EML4-ALK fusion gene group and no EML4-ALK fusion gene group (P=0.941). There was no signifi⁃cant difference in OS between EGFR mutation group and wild-type EGFR group (P=0.607). The values of median OS were 17.7 months, 17.3 months and 16.2 months for EGFR mutant group, EML4-ALK positive group and EML4-ALK negative+ EGFR wild-type group, and thre was no significant difference between them (P=0.915). ConclusionExcluding the thera⁃peutic influence in TKIs, EML4-ALK fusion gene and EGFR mutation status of tumor tissue can not be used as an indepen⁃dent factor in assessing the prognosis in Uygur patients with stageⅣNSCLC.

Key words：carcinoma, non-small-cell lung; receptor, epidermal growth factor; mutation; UYGUR NATIONALITY; non-small cell lung cancer; EML4-ALK; survival analysis

中图分类号：R734.2

文献标志码：A

DOI：10.11958/58911

基金项目：吴阶平医学基金会临床科研专项资助（320.6799.1130）

作者简介：王强（1979），男，主治医师，硕士研究生，主要从事胸部肿瘤的诊断及治疗研究