Wnt2与Dvl蛋白在食管鳞癌组织中的表达及临床意义

王勇涛，王洪江，王兴名，冯雪



Wnt2与Dvl蛋白在食管鳞癌组织中的表达及临床意义

王勇涛，王洪江△，王兴名，冯雪

摘要:目的检测Wnt2与散乱（Dvl）蛋白在食管鳞癌组织中的表达情况，探讨其与食管鳞癌发生发展的关系。方法采用Western blot法分别检测Wnt2、Dvl蛋白在60例食管鳞癌组织及其对应癌旁组织中的表达，并分析其与临床病理特征之间的关系。结果Wnt2和Dvl蛋白在食管鳞癌组织中的相对表达量（0.512±0.406和1.218±1.082）高于癌旁食管组织（0.153±0.189和0.505±0.358），且Wnt2及Dvl蛋白表达在不同浸润深度、TNM分期及淋巴结转移情况中存在差异（P＜0.01）；Wnt2与Dvl蛋白在食管鳞癌组织中的表达呈正相关（r=0.718，P＜0.01）。结论Wnt2、Dvl蛋白的高表达通过Wnt2信号转导通路协同促进食管鳞癌的发生、发展及浸润转移。

关键词：食管肿瘤；癌,鳞状细胞；Wnt2蛋白质；Dvl蛋白质；印迹法,蛋白质

△通讯作者E-mail：whj71210@sina.com

食管癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一，且以鳞癌为主。Wnt/β-catenin信号转导通路的失调与肿瘤的发生密切相关[1]。Wnt2是Wnt信号转导通路的启动因子，它可通过激活Wnt经典信号通路促进肿瘤细胞的生长和侵袭能力，并且参与多种肿瘤的发生发展、侵袭和转移[2]。散乱（Dishevelled，Dvl）蛋白是Wnt2信号通路中的正向调节因子，位于β-catenin上游，在许多肿瘤中均高表达[3]。以Wnt2为代表的Wnt经典信号通路是食管鳞癌中研究较多的信号通路，但Dvl蛋白表达与食管鳞癌的发生发展的相关性国内外少见报道。本研究利用West⁃ern blot法检测60例食管鳞癌组织及其对应癌旁组织中Wnt2、Dvl蛋白的表达，探究其在食管鳞癌发生发展中的作用。

1　资料与方法

1.1一般资料收集新疆医科大学附属肿瘤医院胸外科2011年11月—2014年6月手术切除标本60例，每份标本均包括癌组织和对应癌旁组织（远隔癌组织5 cm以上）。患者年龄42～74岁，平均年龄（62.47±7.14）岁，男42例，女18例；根据食管癌分期2009年（AJCC第7版）分期标准，术后分期Ⅰ期4例，ⅡA期10例，ⅡB期16例，ⅢA期12例，ⅢB期6例，ⅢC期12例。其中有、无淋巴结转移各30例。纳入标准：（1）每份病例均取得对应癌旁组织作为对照，所选病例术后病理证实均为鳞癌。（2）所有患者术前均未行放化疗及生物免疫治疗。本研究经过新疆医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准，所有研究对象知情同意。

1.2实验主要试剂兔抗人总Dvl单克隆抗体（H-260）、兔抗人Wnt2单克隆抗体（H-40）均购自美国SANTA CRUZ公司，通用二抗（羊抗兔）购自北京中杉金桥生物科技有限公司。

1.3标本处理所有组织标本术中离体30 min内立即取材，置于液氮中速冻后移至-80℃冰箱保存备用。

1.4Western blot测定Wnt2、Dvl蛋白水平按照试剂盒说明书提取组织总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度，均衡蛋白浓度后配置上样缓冲液，并于90℃变性5 min。在10%（分离胶）和5%（浓缩胶）SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离，Marker进行位置标记。湿转法将蛋白转至PVDF膜上（90 min）。转膜后5%脱脂牛奶室温封闭2 h。4℃孵育Wnt2、Dvl一抗过夜，洗涤后孵育β-actin二抗，洗膜后使用ECL发光试剂盒曝光显影。Wnt2、Dvl抗体浓度均为1∶400，内参β-actin浓度1∶500，二抗浓度1∶7 500。ECL化学发光试剂盒曝光后所得图像采用Imaging Lab图像分析软件进行分析，将目的蛋白Wnt2、Dvl的调整体积/同一标本内参蛋白β-actin调整体积所得的比值作为目的蛋白的相对表达含量。

1.5统计学方法使用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料用±s表示，癌与癌旁差异比较采用配对t检验，方差不齐采用t′检验；不同临床类型差异比较采用独立样本t检验或方差分析，相关分析采用Pearson法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1Wnt2、Dvl蛋白在癌组织与癌旁组织中的表达Wnt2、Dvl蛋白条带分别位于34 ku和85 ku处，在癌组织及癌旁组织中均有表达，并且Wnt2、Dvl在癌组织中的相对表达量（0.512±0.406和1.218±1.082）高于癌旁食管组织（0.153±0.189和0.505±0.358），差异有统计学意义（t分别为7.804和6.841，P＜0.01），见图1。

Fig. 1 The expression of Wnt2 and Dvl protein in cancer tissue and the tissue adjacent to carcinoma detected by Western blot assay图1　Western blot法测定Wnt2、Dvl蛋白在癌组织与癌旁组织的表达

2.2Wnt2、Dvl蛋白表达与食管鳞癌患者临床病理特征的关系不同浸润深度、不同TNM分期、是否有淋巴结转移患者Wnt2与Dvl蛋白的表达差异均有统计学意义（P＜0.01）。不同性别、年龄、组织分化程度的患者Wnt2与Dvl蛋白的表达差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

Tab. 1 The relationship between Wnt2, Dvl protein and clinicopathological significance表1　Wnt2、Dvl蛋白相对表达量与食管鳞癌患者临床病理特征的关系(±s )

Tab. 1 The relationship between Wnt2, Dvl protein and clinicopathological significance表1　Wnt2、Dvl蛋白相对表达量与食管鳞癌患者临床病理特征的关系(±s )

＊＊P＜0.01

临床病理特征性别年龄组织分化程度浸润深度淋巴结转移TNM分期男女≤62岁>62岁低分化中分化高分化T1+T2 T3+T4有无Ⅰ～ⅡⅢn 42 18 28 32 8 44 8 14 46 30 30 30 30 Wnt2 0.509±0.428 0.520±0.362 0.439±0.382 0.576±0.422 0.551±0.206 0.563±0.443 0.194±0.921 0.220±0.220 0.601±0.409 0.722±0.422 0.302±0.257 0.259±0.231 0.765±0.387 t或F 0.100 1.309 3.041 4.520＊＊4.668＊＊6.137＊＊Dvl 1.208±1.105 1.244±1.058 1.104±0.963 1.319±1.183 0.976±0.601 1.293±1.187 1.048±0.852 0.297±0.233 1.499±1.084 1.812±1.095 0.625±0.675 0.663±0.656 1.774±1.146 t、t′或F 0.117 0.764 0.397 7.007＊＊5.056＊＊4.611＊＊

2.3Wnt2与Dvl蛋白在食管鳞癌表达的相关性分析在食管鳞癌组织中Wnt2蛋白与Dvl蛋白的表达呈正相关（r=0.718，P＜0.01）。

3　讨论

食管癌的发生发展涉及多种基因的改变[4-6]。近年来，Wnt信号转导通路在肿瘤发生发展调控研究中越来越受到重视。目前人类基因组共发现19个Wnt基因，Wnt2被认为是一种癌基因，参与多种肿瘤的发生发展[7-8]。当Wnt2信号转导通路被异常激活时，细胞分泌的Wnt2蛋白与细胞跨膜受体结合后，通过激活细胞内Dvl，使胞质内β-catenin避免与脚手架蛋白Axin、蛋白激酶GSK-3β等形成降解复合物而被降解，当细胞质内β-catenin积累到一定浓度后就会转移至细胞核内，继而与核内转录因子T细胞因子/淋巴增强因子（TCF/LEF）相结合，形成βcatenin-TCF/LEF复合物而启动靶基因细胞周期蛋白（cyclin）、基质金属蛋白酶（MMP）-7、干细胞标志物CD44等的转录，调控细胞生长。

研究显示，Wnt信号转导通路的失调与许多疾病的病理改变及肿瘤的发生发展密切相关[9- 10]。Wang-Saegusa等[11]发现在胃癌组织和细胞中均存在Wnt2高表达，且与浸润深度和淋巴结转移密切相关。同时李韶等[12]研究证实Wnt2经典信号通路及其下游靶基因β-catenin的表达在食管癌的发生发展中起着重要作用，且随病理分期的升高表达逐渐增强。本研究结果显示，Wnt2蛋白在癌组织中的相对表达量明显高于癌旁组织，不同食管鳞癌患者的浸润深度、不同TNM分期、是否有淋巴结转移其表达也不同。

李健等[3]研究发现脑胶质瘤中Dvl蛋白表达水平较健康脑组织明显升高，且与脑胶质瘤病理分级密切相关。另外，Dvl蛋白在乳腺癌、肺癌、宫颈鳞癌等肿瘤中的表达也增高[13-14]。本研究结果显示，Dvl蛋白在癌组织中的相对表达量明显高于癌旁组织，且与Wnt2一样，和食管鳞癌临床病理特征有着共同的关系。

You等[15]报道，抗Wnt2单克隆抗体可使Dvl蛋白失活，下调恶性黑色素瘤细胞诱导细胞凋亡，抑制黑色素瘤体外移植瘤的生长。本研究证实Wnt2和Dvl表达呈正相关，提示两者有协同作用，可促进食管癌细胞的发生发展。

综上所述，Wnt2、Dvl蛋白的高表达与食管鳞癌的发生发展及浸润转移有关；且其高表达提示TNM分期较晚，浸润深度较深，易发生淋巴结转移；有效抑制Dvl蛋白的表达，将有可能抑制Wnt2经典信号通路的转导，或许在食管癌的临床治疗中能够发现新的靶向药物。

参考文献

[1] Ren HY, Li SX, Zhang M, et al. Relationship between Wnt/βcatenin signaling pathway and tumor of digestive system[J].Gastro⁃enterology and Hepatology J,2014,23(6):718-720. [任红艳,李士新,张梅,等. Wnt/β-catenin信号通路和消化系肿瘤的相关性研究[J].胃肠病学和肝病学杂志, 2014, 23(6): 718-720]. doi: 10.3969/j.issn.1006-5709.2014.06.037.

[2] Fu L, Zhang C, Zhang LY, et al. Wnt2 secrered by tumour fibro⁃blasts promotes tumour progression in oesophageal cancer by activa⁃tion of the Wnt/β- catenin signalling pathway[J]. Gut, 2011, 60 （12）: 1635-1643. doi:10.1136/gut.2011.241638.

[3] Li J, Guo G, Fan YM, et al. Expression of Dishevelled protein is cor⁃related with the proliferation and invasion of glioma[J]. Cancer Re⁃search and Clinic,2014,26(4):250-256. [李健,郭庚,范益民,等. Dishevelled蛋白表达与脑胶质瘤增殖、侵袭的相关性研究[J].肿瘤研究与临床, 2014, 26(4): 250- 256]. doi:10.3760/cma.j. issn.1006-9801.2014.04.011.

[4] Moyes LH, Going JJ. Still waiting for predictive biomarkers in Bar⁃ rett′s oesophagus[J]. J Clin Pathol, 2011, 64(9): 742- 750. doi: 10.1136/jclinpath-2011-200084.

[5] Lordick F. Current standard and trends in oesophageal cancer[J]. Eur J Cancer, 2011, 47 (Suppl 3):S353-354. doi: 10.1016/S0959-8049(11)70200-3.

[6] Wang XM, Guo L, Zhang ZQ, et al. The expression and signifi⁃cance of serum c-met in esophageal squamous cell carcinoma of two different nationalities in Xinjiang[J]. Tianjin Med J, 2015, 43 (1): 64-68. [王兴名，郭莉，张志强，等. c-met在新疆哈萨克族与汉族食管鳞癌组织及血清中的表达及意义[J].天津医药, 2015, 43(1): 64-68]. doi: 10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01. 017.

[7] Yu M，Ting DT, Stott SL, et al. RNA sequencing of pancreatic circu⁃lating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis[J]. Na⁃ture, 2012, 487(7408): 510-513. doi: 10.1038/nature11217.

[8] Guo BQ, Lu YY, Huang XM, et al. A preliminary study of serum Wnt2 level in patients with various tumors[J]. Lab Med Clin, 2014, 11(22): 3103-3104. [郭变琴,陆芸瑶,黄学梅,等. Wnt2在不同肿瘤患者血清中水平的探讨[J].检验医学与临床, 2014, 11(22): 3103-3104]. doi:10.3969/j.issn.1672-9455.2014.22.006.

[9] Zhu ZJ, Ruan JS, Li Y, et al. Research progress of Wnt signaling pathway induced EMT in tumor cells[J]. Chinese Pharmacological Bulletin, 2012, 28(7): 904-907. [朱智杰,阮君山,李尧,等. Wnt信号通路诱导肿瘤细胞上皮间质转化的研究进展[J].中国药理学通报, 2012, 28(7): 904- 907]. doi:10.3969/j.issn.1001- 1978.2012.07. 005.

[10] Mora MC, Bassa LM, Wong KE, et al. Rhodiola crenulata inhibits Wnt/beta-catenin signaling in glioblastoma[J]. J Surg Res, 2015, 197(2):247-255. doi: 10.1016/j.jss.2015.02.074.

[11] Wang-Saegusa A, Cugat R, Ares O, et al. Infiltration of plasma rich in growth factors for osteoarthritis of the knee short-term effects on function and quality of life[J]. Arch Orthop Trauma Surg, 2011, 131 (3): 311-317. doi: 10.1007/s00402-010-1167-3.

[12] Li S, Zhang YQ, Xu F, et al. Expression characteristics and patho⁃logical significance of Wnt2 and β-catenin in esophageal carcinoma [J]. Dalian Medical University J, 2012, 34(2): 142-145. [李韶,张云庆,徐飞,等. Wnt2与β-catenin蛋白在食管癌中的表达特点及病理意义[J].大连医科大学学报,2012,34(2):142-145].

[13] Song MS, Salmena I, Pandolfi PP. The functions and regulation of the PTEN tumor suppressor[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2012，13：283-296. doi: 10.1038/nrm3330.

[14] Wei Q, Zhao Y, Yang ZQ, et al. Dishevelled family proteins are ex⁃pressed in non-small cell lung cancer and function differentially on tumor progression[J]. Lung Cancer, 2008, 62(2):181- 192. doi: 10.1016/j.lungcan.2008.06.018.

[15] You L, He B, Xu Z, et al. An anti-Wnt2 monoclonal antibody induc⁃es apoptosis In malignant melanoma cells and inhibits tumor growth [J]. Cancer Res, 2004, 64(15): 5385-5389.

（2015-07-03收稿2015-10-26修回）

（本文编辑魏杰）

作者单位：新疆医科大学附属肿瘤医院胸外科（邮编830011）

Expression and clinical significance of Wnt2 and Dvl protein in esophageal aquamous carcinoma

WANG Yongtao，WANG Hongjiang△，WANG Xingming，FENG Xue
Thoracic Surgery, Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China
△Corresponding Author E-mail: whj71210@sina.com

Abstract:Objective To detect the expressions of Wnt2 and dishevelled (Dvl) protein in esophageal squamous carci⁃noma, and analyze their relationship with the occurrence and development of esophageal squamous cell carcinoma. Meth⁃ods The expression levels of Wnt2 and Dvl protein were detected by Western blot assay in 60 samples of esophageal carci⁃noma and adjacent non-carcinomatous esophageal tissues, and their relationship with clinical pathological features were ana⁃lyzed. Results The relative expression levels of Wnt2 and Dvl protein were higher in esophageal squamous carcinoma tis⁃sue (0.512±0.406, 1.218±1.082) than those of esophageal tissue adjacent to carcinoma (0.153±0.189, 0.505±0.358). There were significant differences in the expression levels of Wnt2 and Dvl protein between different infiltration depth, different TNM stages, and lymph node metastasis (P＜0.01). There was a positive correlation between Wnt2 and Dvl protein in esopha⁃geal squamous carcinoma (r = 0.718, P＜0.01). ConclusionThe high expression levels of Wnt2 and Dvl protein promote the development and metastasis of esophageal squamous cell carcinomas collaboratively via Wnt2 signal transduction path⁃ways.

Key words:esophageal neoplasms; carcinoma, squamous cell; Wnt2 protein; Dvl protein; blotting, Western

中图分类号：R735.1

文献标志码：A

DOI：10.11958/20150007

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81160271）

作者简介：王勇涛（1986），男，硕士在读，主要从事食管癌的外科治疗和基础研究