流动注射法探究模拟酶催化过氧亚硝酸根氧化酪氨酸的动力学特征

安学静、罗云敬、张辰暘

北京工业大学生命科学与生物工程学院、北京 100124

流动注射法探究模拟酶催化过氧亚硝酸根氧化酪氨酸的动力学特征

安学静、罗云敬*、张辰暘

北京工业大学生命科学与生物工程学院、北京 100124

流动注射分析仪； 氯化血红素； 血红蛋白； 过氧亚硝酸根

引 言

过氧亚硝酸根(Peroxynitrite、ONOO-)是生物体内产生的活性氧化合物、具有强硝化、氧化和致癌性、能与生物体内的DNA、蛋白质、脂质以及维生素等生物大分子反应而诱发心脑血管等疾病[1]。表征ONOO-分子活性的研究方法主要集中在紫外-可见光度法、荧光光谱法、电化学法和化学发光法。过氧亚硝酸根对细胞损伤作用迅速、且在生物体内含量较低、易降解、对其在含量的测定十分困难。目前、检测ONOO-含量的方法主要集中在荧光探针法和非酶反应法[2]、但荧光探针合成困难、选择性差； 非酶反应法灵敏度差、而酶催化反应法可克服上述缺点、有望检测生物体的ONOO-含量。王瑞勇等[2]建立了测定ONOO-含量的新方法、基于模拟酶能够催化ONOO-氧化酪氨酸产生具有荧光特性的二聚体酪氨酸的反应原理、利用荧光光谱法测定了其含量、效果令人满意。

荧光光谱法反映了模拟酶催化ONOO-氧化反应的静态猝灭过程、对于模拟酶催化该体系的反应机制却不甚明了[3-7]。流动注射分析仪是研究快速反应动力学的重要手段、在分子水平和生化反应机理研究方面发挥着重要作用、但对于其应用在模拟酶催化的动力学机理的研究方面鲜有报道[8-10]。Michael等[11]利用停流荧光法研究发现酶的催化活性是通过高能级到基态之间的动态转化过程实现的； 李永生等[12]利用流动注射光谱法建立了过氧化物酶活性的测定方法。尚未见血红蛋白或氯化血红素催化过氧亚硝酸根对酪氨酸催化反应机理和动力学参数的报道。鉴于此、本实验利用流动注射法探究血红蛋白和氯化血红素催化ONOO-氧化酪氨酸的动力学行为、计算两种酶催化该体系的Km和Vmax、从而比较血红蛋白和氯化血红素催化该体系的反应机理和不同催化活性、得到不同温度、pH值下的速率常数、对模拟酶催化法测定ONOO-含量、动力学催化机理及其引起疾病的防治具有潜在的生物学意义。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

SFM-300/MOS-250流动注射仪与光谱分析系统(法国比奥罗杰公司)、Bio-Kine32V4.27动力学曲线模拟软件(法国比奥罗杰公司)、PHS-25数显酸度计(上海精密科学仪器公司)、ER-182A电子天平(上海天平仪器厂)、TB-85水浴循环装置(日本岛津公司)、PR020XXM1纯水机(北京PALL纯水公司)。

血红蛋白(Hemoglobin、Hb)和氯化血红素(Hemin)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司、二甲基亚砜(DMSO)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase、SOD)、酪氨酸(Tyrosine、Tyr)购自上海安谱实验科技股份有限公司、4 ℃保存。实验用缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液、实验用水均为二次去离子水、其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

将反应溶液分别注入流动注射分析仪的S1、S2和S3注射器中、于水浴中充分反应、S1：3 mL 1.0 mmol·L-1的Tyr和1 mL 0.25 μmol·L-1的Hb/Hemin混合液； S2：10 mL 0.24 μmol·L-1的ONOO-溶液； S3：10 mL Tris-HCl缓冲液、S1∶S2∶S3=1∶3∶1、λex/em=317/408 nm。流通池体积为100 μL、光程为10 mm、仪器死时间为1.0 ms、狭缝宽为2.5 nm。Hb、Hemin、ONOO-、Tyr的终浓度分别为注入时的1/20、1/20、3/5、3/20。

2 结果与讨论

2.1 模拟酶催化ONOO-氧化Tyr反应机理的推断

酪氨酸具有荧光特性、在λex/em=230/305 nm下能够检测其荧光强度。模拟酶具有催化特性、能催化ONOO-氧化Tyr、对Tyr的荧光强度具有静态猝灭作用、产物为具有荧光特性的酪氨酸二聚体、其激发波长和发射波长分别为317和408 nm。Tyr对酪氨酸二聚体荧光强度的变化没有干扰、且二聚体性质稳定、可根据检测其荧光强度的大小及变化推断模拟酶催化该体系的动力学特性。

实验考察了不同浓度Tyr在Hb和Hemin两种模拟酶催化下对产物二聚体荧光强度影响的动力学曲线[图1(a)]、显示浓度较低时、初速率均随着Tyr浓度的增加而增强、表现为一级反应、当Tyr浓度为1.0 mmol·L-1时、曲线与0.9 mmol·L-1时几乎重合、当浓度继续增大时、二聚体荧光强度均不再增强、反应初速率均不再增大、说明Tyr已达到饱和、表现为零级反应、符合典型的酶催化反应的特征、遵循Michaelis-Menten的动力学规律。

根据流动注射分析仪中的动力学曲线模拟软件Bio-Kine、计算出反应初速率V0(dIF/dt) 与Tyr浓度的关系(图2)。

由截距1/Vmax和斜率Km/Vmax算出以Tyr为底物两种酶催化的Km和Vmax分别为：

图1 催化的不同Tyr动力学曲线(a) Hb和(b) Hemin

Fig.1 Kinetic curve of dimer Tyr with different Tyr concentration catalyzed by (a) Hb and (b) Hemin

图2 不同浓度Tyr的Lineweaver-Burk图

同时、实验以不同浓度ONOO-(6×10-7～4×10-5mol·L-1)为底物探究了其对Hb和Hemin催化该体系的反应初速率的影响情况、结果见图3(a)和(b)。

图3 催化的不同ONOO-动力学曲线(a) Hb和(b) Hemin

Fig.3 Kinetic curve of dimer Tyr with different ONOO-concentration catalyzed by (a) Hb and (b) Hemin

图4 不同浓度ONOO-的Lineweaver-Burk图

2.2 不同温度下两种酶催化活性的比较

温度是影响酶活性的重要影响因素之一。本实验在生理pH下考察了不同温度(15、25、30、37、45 ℃)对两种酶催化该体系的影响。利用流动注射分析仪得到在不同温度下及不同浓度的两种酶时的动力学曲线、根据动力学曲线模拟软件Bio-Kine拟合出表观速率常数kobs(见表1)。

表1 不同温度下随Hb浓度变化的kobs

表2 不同温度下随Hemin浓度变化的kobs

将动力学曲线模拟软件Bio-Kine拟合出的kobs代入公式kobs=k0+[catalyst]kcat、作kobs与酶浓度图(见图5)、其中k0为无酶时的kobs、[catalyst]为酶的浓度、斜率即为kcat。

由表1可以看出：37 ℃下、无Hb时、反应的kobs均很低、Hb的浓度由0.5 nmol·L-1增加到50 nmol·L-1时、其对应的kobs由0.009 0 s-1增大到0.025 8 s-1、由此说明反应的kobs随着Hb的增加而增大、从而得出Hb对ONOO-氧化Tyr的反应具有显著的催化作用。

图5 不同温度下催化该体系的反应速率

再由图5(a)可以得出：Hb在15,25,30,37和45 ℃下催化ONOO-氧化Tyr的反应速率常数kcat分别为3.043×105、7.705×105、4.418×105、3.373×105、1.127×105mol·L-1·s-1。结果表明：Hb对ONOO-氧化Tyr的反应的催化活性受到温度的影响、温度较低时、随着温度的升高、kcat变大； 温度上升至25 ℃时、速率常数达到最大值kcat=7.705×105mol·L-1·s-1、此温度下催化反应速率最快； 温度继续上升、反应速率呈下降趋势、当温度上升至45 ℃时应速率最慢kcat=1.127×105mol·L-1·s-1、下降了85.37%、说明Hb催化该体系时适宜在比较温和(常温)条件下进行。

由表2和图5(b)得知：不同温度下、无Hemin时反应的kobs均很低、且随着Hemin的增加、相应的kobs不断增大、说明Hemin对该体系同样具有明显的催化作用； 同时、温度对Hemin催化氧化Tyr的反应具有明显影响。Hemin在15、25、30、37和45 ℃下催化ONOO-氧化Tyr的反应速率常数kcat分别为0.861×105、1.059×105、1.652×105、3.679×105、2.321×105mol·L-1·s-1。结果显示：随着温度的升高、Hemin催化该体系的kcat不断增大、在25、30和37 ℃时分别加快了1.23、1.56和2.23倍、从37到45 ℃时、速率减慢了1.59倍、说明Hemin催化该体系的最适条件为生理温度37 ℃下。

数据显示、Hb和Hemin催化该体系的现象均符合酶催化受温度影响的一般规律、Hb在最适温度下的kcat=7.705×105mol·L-1·s-1显著大于Hemin在最适温度下的kcat=3.679×105mol·L-1·s-1、是Hemin的2.09倍。

2.3 不同pH值下两种酶催化活性的比较

pH值是影响酶活性的又一重要影响因素。本文进一步考察了Hb在最适温度25 ℃下pH值分别为7.0、7.5、8.0和8.5、Hemin在最适温度37 ℃下pH值分别为8.5、9.0、9.5和10.0下催化该体系的kcat。由于Hemin不易溶于水、而易溶于NaOH溶液、因此实验监测了其在偏碱性条件下的催化活性。得到不同pH值不同酶浓度的kobs(见表3)。

表3 不同pH下随Hb浓度变化的kobs

表4 不同温度下随Hemin浓度变化的kobs

图6 不同pH下催化该体系的反应速率(a) Hb和(b) Hemin

由表2得出不同pH值条件下不同浓度的两种酶的kcat。由图6(a)得知：pH 7.0、7.5、8.0和8.5时、Hb催化该体系的kcat分别为7.861×105、8.237×105、1.035×106和9.058×105mol·L-1·s-1、根据不同浓度Hb在不同pH值时的kcat可以看出、pH 8.0>8.5>7.5>7.0、随着pH值的增加kcat增大、当pH达到8.0时、kcat不再增大、说明Hb催化该体系的kcat达到最大、进而阐明Hb催化ONOO-氧化Tyr的反应适宜在pH 8.0条件下进行。

再由图6(b)得知：pH 8.5、9.0、9.5和10.0时、Hemin催化该体系的kcat分别为3.682×105、4.104×105、6.842×105和5.079×105mol·L-1·s-1、pH 9.5>10.0>9.0>8.5、因此Hemin在pH 9.5时kcat达到最大、说明Hemin催化ONOO-氧化Tyr的最适宜反应pH值为9.5。最适pH下、Hb催化该体系的kcat=1.035×106mol·L-1·s-1与Hemin催化该体系的kcat=6.842×105mol·L-1·s-1相比较、Hb是Hemin的2.81倍。

pH对模拟酶的影响主要作用于模拟酶活性中心或者相关位点基团的解离状态[12]、不同pH值下其解离状态不尽相同。由数据显示、pH对Hb和Hemin催化活性的影响均是先随pH增大而增强、达到最适pH后开始下降、说明该催化反应随pH变化的曲线为钟罩型[12]、符合酶催化受pH影响的典型特征。

3 结 论

通过对模拟酶催化该体系动力学的研究、反映出模拟酶催化法研究ONOO-的氧化反应机制和生物酶的催化信息、为探究生物体内高活性自由基反应机理、建立高灵敏度的新方法测定ONOO-含量、揭示酶反应的实质以及ONOO-所引起相关疾病的预防和治疗具有潜在的生物学研究意义。

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[12] LI Yong-sheng,ZHENG Wei,GAO Xiu-feng(李永生、郑 魏、高秀峰). Chinese Journal of Analytical Chemistry(分析化学),2015,43(10): 1580.

*Corresponding author

Research on the Reaction Dynamics between Peroxynitrite and Tyrosine Catalyzed with Mimic Enzyme through Flow Injection Analyzer

AN Xue-jing,LUO Yun-jing*,ZHANG Chen-yang

College of Life Science and Bioengineering,Beijing University of Technology,Beijing 100124,China

Flow injection analyzer; Hemin; Hemoglobin; Peroxynitrite

Dec. 14,2015; accepted Apr. 19,2016)

2015-12-14、

2016-04-19

北京市教育委员会科技计划面上项目(KM201210005032)和国家科技支撑计划项目(2015BAK44B00)资助

安学静、1990年生、北京工业大学生命科学与生物工程学院 e-mail: anxuejing@emails.bjut.edu.cn *通讯联系人 e-mail: luoyj@bjut.edu.cn

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)12-4052-06