杜仲幼果和叶片MVA途径基因表达差异分析

王　淋，乌云塔娜，叶生晶

(1 中国林业科学研究院 经济林研究开发中心，河南 郑州 450003；2 国家林业局杜仲工程技术研究中心，河南 郑州 450003；3 国家林业局 中南林业调查规划设计院，湖南 长沙 410014 )



杜仲幼果和叶片MVA途径基因表达差异分析

王淋1,2，乌云塔娜1,2，叶生晶3

(1 中国林业科学研究院 经济林研究开发中心，河南 郑州 450003；2 国家林业局杜仲工程技术研究中心，河南 郑州 450003；3 国家林业局 中南林业调查规划设计院，湖南 长沙 410014 )

[摘要]【目的】 杜仲橡胶是一种多萜类物质，而甲羟戊酸(MVA)途径是合成萜类物质的重要途径之一。分析杜仲MVA途径相关基因表达的差异，预测杜仲橡胶合成的主要上游途径。【方法】 在杜仲幼果和叶片转录组测序的基础上，根据基因功能注释和表达分析，确定MVA途径的系列基因，并对其进行表达差异分析。【结果】 杜仲橡胶合成的MVA途径共涉及23条Unigene，分别为3条EuACOT、3条EuHMGS、8条EuHMGR、2条EuMK、1条EuPMK和6条EuMDP基因。根据转录组RPKM(Reads Per Kilo bases per Million reads)数据对基因表达差异进行分析，结果表明杜仲MVA途径中的EuACOT8、EuACOT10、EuHMGS4、EuHMGS5、EuHMGS6、EuHMGR18、EuMK3、EuMK4、EuMDP7、EuMDP8、EuMDP9、EuMDP10、EuMDP11基因在幼果和叶片中的表达量具有显著差异，其中仅EuMDP9在叶片中的表达量大于幼果，而其余基因在幼果的表达量大于叶片；EuHMGR15和EuHMGR17只在幼果中特异表达。【结论】 MVA途径绝大部分基因在果实中大量表达，这与果实中杜仲橡胶含量远超过叶片的现象相吻合，推测杜仲果实MVA途径为杜仲橡胶合成的主要途径。

[关键词]杜仲；幼果和叶片；甲羟酸途径；基因表达差异

杜仲(EucommiaulmoidesOlives) 是中国特有的名贵滋补药材，具有补肝肾、益筋骨、安胎等多种功效[1]；除此之外，杜仲叶片、果实、树皮、根中均含有大量的天然胶状物质——杜仲橡胶 (EucommiaulmoidesRubber，EUR)。杜仲橡胶是温带地区重要的胶源，杜仲树在温带地区适生面积较广。杜仲橡胶与天然三叶橡胶的化学成分相同，但化学结构不同，天然橡胶为顺式聚异戌二烯，而杜仲橡胶为反式聚异戌二烯，这种独特的橡塑二重性质决定了杜仲橡胶具有重要的经济价值[2-3]。杜仲果实和叶片中橡胶含量有明显差异，一般而言，果实含胶率为10%～12%，叶片含胶率仅为1%～3%[4]。因此，进行不同组织的基因表达与橡胶含量的相关性研究，比较分析橡胶合成相关基因的表达差异，阐明基因表达差异与橡胶含量的动态变化关系，可以揭示杜仲橡胶合成的基因调控机制。

杜仲橡胶属于多萜类化合物质，Chaykin等[5]和Lynen等[6]首次提出了萜类物质合成的甲羟戊酸(Mevalonate，MVA)途径，且该途径主要位于细胞质中，又被称为细胞质途径。Takeshi等[7]利用同位素标定法标记萜类物质合成MVA 途径代谢的中间产物发现，在杜仲的含胶细胞中存在MVA代谢途径，提出杜仲橡胶生物合成与MVA代谢途径有关及杜仲橡胶是反式聚异戊二烯的观点。到目前为止，杜仲中已分离鉴定的萜类物质有16种以上，MVA途径主要包括6步化学反应：① 3分子的乙酰CoA在乙酰乙酰CoA硫解酶(Acetyl-CoAacethyl transferase，ACOT)的催化作用下生成乙酰乙酰辅酶A；② 乙酰乙酰辅酶A在3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合成酶(3-Hydroxyl-3-methylglutaryl-CoAsynthase，HMGS)的催化作用下生成3-羟基-3-甲基戊二酰CoA；③ 3-羟基-3-甲基戊二酰CoA经3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR)催化生成甲羟戊酸；④甲羟戊酸在MVA甲羟戊酸激酶(Mevalonate kinase，MK)的磷酸化作用下形成5-磷酸-甲羟戊酸；⑤ 5-磷酸-甲羟戊酸随后在甲羟戊酸磷酸激酶(5-phosphate-mevalonate kinase，PMK)的作用下生成甲羟戊酸焦磷酸；⑥甲羟戊酸焦磷酸在甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(Mevalonate-5-diphosphate decarboxylase，MDC)的作用下脱羧生成异戊烯基焦磷酸IPP(IsopentenyI-PP)[8-11]。

近年来，转录组研究在RNA水平上可获得高通量基因表达水平的相关信息，而且是解析基因表达差异、新基因发掘、基因结构功能研究的有效方法之一[12-13]。基于Illumina/Solexa高通量测序平台的转录组测序技术具有高度自动化、读取片段多、适合进行各种大小片段的测序、能够在单核苷酸水平检测对任意物种的整体转录情况等多种功能[14-15]。本研究根据李铁柱等[16-17]已构建的杜仲果实和叶片转录组数据库，将杜仲幼果和叶片转录组中的Unigene根据GO功能分析得出萜类化合物生物合成的代谢通路，对其幼果和叶片萜类合成MVA途径基因的表达差异进行了分析，阐明基因表达差异与橡胶含量的动态变化关系，以期为杜仲萜类化合物尤其是杜仲橡胶的生物合成途径及其分子调控机理研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

选取中国林业科学研究院经济林研究开发中心(国家林业局泡桐研究开发中心)国审良种‘华仲6号’杜仲的幼果(授粉后50 d，杜仲橡胶合成第1个高峰期)和叶片(展叶后55 d，橡胶含量较高)为试验材料，液氮速冻后，-80 ℃保存备用。

1.2杜仲样品RNA的提取

分别取杜仲幼果和叶片约100 mg，采用Omega公司的Plant RNA Kit试剂盒提取杜仲幼果和叶片的总RNA，提取完毕测定总RNA品质，如果A260/A280比值在1.8～2.2，表明提取的RNA符合要求。将杜仲幼果和叶片的RNA(约2 μg)送至深圳华大基因公司进行转录组测序及基因功能注释。

1.3转录组测序及Unigene功能注释方法

深圳华大基因公司采用Illumina技术进行测序，首先是将细胞中的所有转录产物反转录为cDNA文库，然后将cDNA文库中的DNA随机剪切为小片段(或将RNA片段化后再反转录)，这样可产生了成千上万的短cDNA reads，然后再进行Illumina测序。获得序列数据后，对测序序列进行拼接组装，首先使用短reads组装软件SOAP denovo做转录组从头组装，然后利用paired-end reads对Scaffold做补洞处理，最后将Unigene序列与蛋白数据库nr、Swiss-Prot、KEGG和COG做blastx比对(期望值<0.000 01)，取比对结果最好的蛋白确定Unigene的序列方向。Unigene的表达量计算使用RPKM法(Reads Per kb per Million reads)，其计算公式如下：

式中:设RPKM为Unigene A的表达量，则C为唯一比对到Unigene A的reads数，N为唯一比对到所有Unigene的总reads数，L为Unigene A的碱基数[18]。

2结果与分析

2.1杜仲萜类物质合成MVA途径的代谢位点

将杜仲幼果和叶片Unigene输入到KEGG数据库，结果发现MVA合成途径共有6个基因23条Unigene被注释，如图1所示，其中代谢位点2.3.1.9为乙酰乙酰CoA硫解酶 (Acetyl-CoA acethyl transferase，ACOT)，共被注释3条Unigene，记为EuACOT8-10；代谢位点2.3.3.10为3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合成酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase，HMGS)，被注释3条Unigene，记为EuHMGS4-6；代谢位点1.1.1.34为3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR)，被注释8条Unigene，记为EuHMGR12-19；代谢位点2.7.1.36为甲羟戊酸激酶 (Mevalonate kinase，MK)，被注释2条Unigene，记为EuMK3-4；代谢位点2.7.4.2为甲羟戊酸磷酸激酶 (5-phosphate-mevalonate kinase，PMK)，被注释1条Unigene，记为EuPMK3；代谢位点4.1.1.33为甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶 (Mevalonate-5-diphosphate decarboxylase，MDP)，被注释6条Unigene，记为EuMDP6-11。

图 1　杜仲MVA途径代谢位点

2.2杜仲乙酰乙酰CoA硫解酶基因(EuACOT)的确定及表达差异

2.2.1EuACOT的确定从杜仲幼果和叶片的转录组数据中发现，杜仲幼果和叶片ACOT基因均有3条Unigene被注释，与油茶(Camelliaoleifera,ADD10719.1)和烟草(Nicotianatabacum,AAU95619.1)的ACOT基因相似性达到82%～91%(表1)，因此命名为EuACOT基因，继杜仲成熟果实EuACOT1-7基因家族[19]，命名为EuACOT8-10。

表 1　杜仲幼果和叶片EuACOT基因的相关信息

2.2.2EuACOT在杜仲幼果和叶片中的表达量差异乙酰乙酰CoA硫解酶是萜类物质合成MVA途径的起始酶，对众多蛋白的乙酰化具有修饰作用[20-21]。由图2可见，EuACOT在杜仲幼果和叶片中均有表达，且在幼果中的表达量均大于叶片；其中EuACOT8和EuACOT10在幼果中的表达量显著高于叶片。无论在杜仲幼果还是叶片中，EuACOT的表达量大小顺序均为EuACOT8>EuACOT10>EuACOT9。

2.3杜仲3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合成酶基因(EuHMGS)的确定及表达差异

2.3.1EuHMGS的确定从杜仲幼果和叶片的转录组数据中发现，杜仲幼果和叶片HMGS基因有3条Unigene被注释，与烟草属观赏烟(N.langsdorffii×N.sanderae,ABV02025.1)、喜树(Camptothecaacuminata,ACD87446.1)的HMGS基因相似性达到61%～89%(表2)，因此命名为杜仲的Eu-HMGS基因，继杜仲成熟果实EuHMGS1-3基因家族[19]，记为EuHMGS4-6。

图 2　EuACOT基因在杜仲幼果和叶片中的差异表达

Unigene命名UnigenenameUnigene编号UnigeneID长度/bpLength参考序列ID号ReferencesequenceID物种Species期望值E-value相似度/%SimilarityEuHMGS4103121525ABV02025.1观赏烟Nicotianalangsdorffii×Nicotianasanderae089EuHMGS51361924ACD87446.1喜树Camptothecaacuminata087EuHMGS640010558ABV02025.1观赏烟Nicotianalangsdorffii×Nicotianasanderae7e-6261

2.3.2EuHMGS基因在杜仲幼果和叶片中的表达量差异从图3可以看出，EuHMGS家族的成员在杜仲幼果和叶片中均有表达，且在幼果中的表达量显著高于叶片。无论在幼果还是叶片中，其表达量大小顺序均为EuHMGS5>EuHMGS4>EuHMGS6。

图 3　EuHMGS在杜仲幼果和叶片中的差异表达

2.4杜仲3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶基因(EuHMGR)的确定及表达差异

2.4.1EuHMGR的确定从杜仲幼果和叶片的转录组数据中发现，杜仲幼果和叶片HMGR基因均有8条Unigene被注释，与杜仲(E.ulmoides,AAV54051.1)、黄龙胆(Gentianalutea,BAE92730.1)、烟草(N.tabacum,AAB87727.1)、胡黄连(Picrorhizakurrooa，ABC74565.1)、丹参(Salviamiltiorrhiza，ACD37361.1)、黄龙胆(Gentianalutea，BAE92730.1)、喜树(C.acuminata，P48021.1) 的HMGR基因相似性达到53%～99%(表3)，命名为EuHMGR基因，继杜仲成熟果实EuHMGR1-11家族基因[19]，命名为EuHMGR12-19。

2.4.2EuHMGR基因在幼果和叶片中的表达量差异从图4可以看出，家族成员EuHMGR15和EuHMGR17在幼果中特异表达，而其他EuHMGR家族成员在幼果和叶片中均有表达；EuHMGR14和EuHMGR19在叶片中的表达量大于幼果，而其他EuHMGR家族成员的表达量均是幼果大于叶片，其中EuHMGR18在幼果中的表达量显著高于叶片。

2.5杜仲甲羟戊酸激酶基因(EuMK)的确定及表达差异

2.5.1EuMK的确定从杜仲幼果和叶片的转录组数据中发现，杜仲幼果和叶片MK基因均有2条Unigene被注释，与橡胶树(Heveabrasiliensis,AAL18925.1)的MK基因相似性达到77%～85%(表4)，命名为EuMK基因，继成熟果实EuMK1-2基因家族[19]，命名为EuMK3-4。

表 3　杜仲幼果和叶片EuHMGR基因的相关信息

Unigene命名UnigenenameUnigene编号UnigeneID长度/bpLength参考序列IDReferencesequenceID物种Species期望值E-value相似度/%SimilarityEuMK3189271094AAL18925.1橡胶树Heveabrasiliensis1e-17277EuMK42112480AAL18925.1橡胶树Heveabrasiliensis6e-3385

2.5.2EuMK在杜仲幼果和叶片中的表达量差异从图5可以看出，EuMK家族成员在杜仲幼果和叶片中均有表达，且在幼果中的表达量显著高于叶片，无论是果实还是叶片中，表达量大小均为EuMK3>EuMK4。

2.6杜仲甲羟戊酸磷酸激酶基因(EuPMK)的确定及表达差异

2.6.1EuPMK的确定从杜仲幼果和叶片的转录组数据中发现，杜仲幼果和叶片PMK基因均有1条Unigene被注释，与茶(Camelliasinensis,AFC34137.1)的PMK基因相似性达到90%(表5)，故命名为EuPMK基因，继杜仲成熟果实EuPMK1-2基因家族[19]，命名为EuPMK3。

图 5　EuMK基因在杜仲幼果和叶片中的差异表达

Unigene命名UnigenenameUnigene编号UnigeneID长度/bpLength参考序列IDReferencesequenceID物种Species期望值E-value相似度/%SimilarityEuPMK3103211817AFC34137.1 茶Camelliasinensis090

2.6.2EuPMK基因在幼果和叶片中的表达量差异从图6可以看出，EuPMK3基因在杜仲幼果和叶片中均有表达，且在幼果中的表达量大于叶片。

2.7杜仲甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因(EuMDP)的确定及表达差异

2.7.1EuMDP的确定从杜仲幼果和叶片的转录组数据中发现，杜仲幼果和叶片MDP基因有6条Unigene被注释，与橡胶树(Heveabrasiliensis,AAL18927.1，BAF98285.1)、烟草属观赏烟(N.langsdorffii×N.sanderae,ABV02028.1)、人参(Panaxginsen,ADI80345.1)的MDP基因相似性达到82%～89%(表6)，命名为EuMDP基因，继成熟果实EuMDP1-5基因家族[19]，记为EuMDP6-11。

图 6　EuPMK在杜仲幼果和叶片中的差异表达

Unigene命名UnigenenameUnigene编号UnigeneID长度/bpLength参考序列ID号ReferencesequenceID物种species期望值E-value相似度/%SimilarityEuMDP62961485AAL18927.1橡胶树Heveabrasiliensis5e-1782EuMDP741324240ABV02028.1观赏烟Nicotianalangsdorffii×Nicotianasanderae2e-3689EuMDP845009224ABV02028.1观赏烟Nicotianalangsdorffii×Nicotianasanderae2e-4088EuMDP946901275ADI80345.1人参Panaxginsen1e-2689EuMDP1047529306ADI80345.1人参Panaxginsen1e-2689EuMDP116878952BAF98285.1橡胶树Heveabrasiliensis9e-16084

2.7.2EuMDP在杜仲幼果和叶片中的表达量差异从图7 可以看出，EuMDP家族成员在幼果和叶片中均有表达，其中EuMDP6和EuMDP9在叶片中的表达量大于幼果，其余成员表达量均是幼果大于叶片；除了EuMDP6在幼果与叶片中的表达量无显著差异外，杜仲EuMDP家族其他成员在幼果与叶片中的表达量均存在显著差异。

图 7　EuMDP在杜仲幼果和叶片中的差异表达

3讨论与结论

本研究结果表明，萜类物质合成MVA途径共涉及23条Unigene，其中包括3条ACOT(EuACOT8-10)、3条HMGS(EuHMGS4-6)、8条HMGR(EuHMGR12-19)、2条MK(EuMK3-4)、1条PMK(EuPMK3)、6条MDP(EuMDP6-11)。利用RPKM法对杜仲幼果和叶片转录组基因表达水平进行计算分析，可以消除基因长度和测序量差异对基因表达丰度的影响[16-17,22]，从而可直接准确地反应基因的表达水平，为分析基因表达情况提供了方便有效的方法。根据杜仲幼果和叶片转录组RPKM数据分析，杜仲MVA途径中的EuACOT8、EuACOT10、EuHMGS4、EuHMGS5、EuHMGS6、EuHMGR18、EuMK3、EuMK4、EuMDP7、EuMDP8、EuMDP9、EuMDP10、EuMDP11基因在杜仲幼果和叶片中的表达量具有显著差异，EuHMGR15和EuHMGR17在幼果中特异表达。另外，幼果和叶片中表达量具有显著差异的基因中，仅EuMDP9在叶片中的表达量大于幼果，其余基因在杜仲幼果中的表达量大于叶片。综上所述，杜仲果实和叶片中均存在萜类合成的MVA代谢途径，且基因表达量在果实和叶片中具有明显差异，果实的基因表达量显著高于叶片，这与果实中杜仲橡胶含量远超过叶片相一致，推测杜仲橡胶合成的上游途径主要以MVA途径为主。

萜类是一大类植物次生代谢产物，结构复杂、种类繁多[23]。MVA途径相关酶基因主要参与萜类物质的合成，且对光合作用、呼吸作用、生长发育的调节，细胞内信号传导以及细胞膜结构和功能等重要生物学进程有影响，对细胞代谢的诸多方面以及细胞膜的结构和功能发挥着重要作用。Wititsuwannakul等[24]证明巴西橡胶HMGR基因的表达量与其橡胶含量相关；Chappell[25]等将仓鼠的HMGR基因转入烟草中，结果提高了总的 HMGR 酶活性，同时甾醇的含量也有一定增加；Ren Chen等[26]将EuIPI基因转入杜仲，从而提高了转基因杜仲中反式聚异戊二烯的含量，推测EuIPI的表达调控可提高杜仲产胶量。因此，综上所述，将MVA途径相关基因表达量提高或抑制其表达应该会对IPP的表达调控产生影响，亦或是MVA途径相关基因结合IPP基因一起调控下游杜仲胶合成关键基因的表达可以影响反式聚异戊二烯的含量，即合成杜仲胶的含量。

[参考文献]

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典 [M].北京:化学工业出版社,2005:114-115.

Pharmacopoeia Commission of the People’s Republic of China.Pharmacopoeia of the People’s Republic of China [M].Beijing:Chemical Industry Press,2005:114-115.(in Chinese)

[2]杜红岩.我国的杜仲胶资源及其开发潜力与产业发展思路 [J].经济林研究,2010,28(3):1-6.

Du H Y.Discussion on industry development and exploration potential of gutta-percha resource in China [J].Nonwood Forest Research,2010,28(3):1-6.(in Chinese)

[3]薛萍.杜仲研究现状与发展前景 [J].经济林研究,1995,13(3):56-58.

Xue P.Research status and development prospects ofEucommiaulmoidesOliv [J].Nonwood Forest Research,1995,13(3):56-58.(in Chinese)

[4]杜红岩,杜兰英,傅建敏,等.杜仲不同器官含胶率的差异及其相关性分析 [J].中南林业科技大学学报(自然科学版),2006,26(4):1-4.

Du H Y,Du L Y,Fu J M,et al.The difference and its pertinence analysis of the gutta-percha contentin organs ofEucommiaulmoidesOliv [J].Journal of Central South University of Forestry & Technology(Nat Sci Ed),2006,26(4):1-4.(in Chinese)

[5]Chaykin S,Law J,Phillips A H,et al.Phosphorylated intermediates in the synthesis of squalene [J].PNAS,1958,44(10):998-1004.

[6]Lynen F,Efferer H,Henning U,et al.Farnesyl-pyrophosphatund 3-Methyl-Δ3-butenyl-1-pyrophosphat,die biologischen vorstufendes squalens zur biosyntheseder terpene,Ⅲ [J].Angewandte Chemie,1958,70(24):738-742.

[7]Takeshi B,Michiko M,Koichirou G,et al.Contribution of mevalonate and methylerythritol phosphate pathways to polyisoprenoid biosynthesis in the rubber-producing plantEucommiaulmoidesOliver [J].Z Naturforsch C,2010,65:363-372.

[8]兰文智,余龙江,蔡永军,等.类异戊二烯非甲羟戊酸代谢途径的分子生物学研究进展 [J].西北植物学报,2001,21(5)：1039-1047.

Lan W Z,Yu L J,Cai Y J,et al.Advance on molecular biology of isoprenoids non-mevalonate patnway [J].Acat Botanica Boreali-Occiden Sinica,2001,21 (5)：1039-1047.(in Chinese)

[9]韩军丽,李振秋,刘本叶.植物萜类代谢工程 [J].生物工程学报,2007,23(4):561-569.

Han J L,Li Z Q,Liu B Y.Metabolic engineering of terpenoids plants [J].Chinese Journal of Biotechnology,2007,23(4):561-569.(in Chinese)

[10]Mann V,Harker M,Pecker I,et al.Metabolic engineering of astaxanthin production in tobaccof lowers [J].Nat Biotechnol,2000,18:888-892.

[11]Lichtenthaler H K.The 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate path- way of isoprenoid biosynthesis in plants [J].Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol,1999,50:47-65.

[12]祁云霞，刘永斌，荣威恒.转录组研究新技术：RNA-Seq 及其应用 [J].遗传,2011,33(11):1191-1202.

Qi Y X,Liu Y B,Rong W H.RNA-Seq and its applications:a new technology for transcriptomics [J].Hereditas,2011,33(11):1191-1202.(in Chinese)

[13]井赵斌，魏琳，俞靓，等.转录组测序及其在牧草基因资源发掘中的应用前景 [J].草业科学,2011,28(7):1364-1369.

Jing Z B,Wei L,Yu L,et al.Transcription sequencing and its application prospective on discovering the gene resources of forages [J].Pratcultural Science,2011,28(7):1364-1369.(in Chinese)

[14]Wang X W,Luan J B,Li J M,et al.De novo characterization of a whitefly transcriptome and analysis of its gene expression during development [J].BMC Genomics，2010,24(11):400.doi:10.1186/1471-2164-11-400.

[15]侯志伟,王赟,高宏,等.dRNA-seq原理及其在原核生物转录组学研究中的应用 [J].遗传,2013,35(8):983-991.

Hou Z W,Wang Y,Gao H,et al.The principle of dRNA-seq and its applications in prokaryotic transcriptome analyses [J].Hereditas,2013,35(8):983-991.(in Chinese)

[16]李铁柱,杜红岩,刘慧敏,等.杜仲果实和叶片转录组数据组装及基因功能注释 [J].中南林业科技大学学报(自然科学版),2012,32(11):22-30.

Li T Z,Du H Y,Liu H M,et al.Transcriptome data assembly and gene function annotation ofEucommiamaturefruits and leaves [J].Journal of Central South University of Forestry & Technology (Nat Sci Ed),2012,32(11):22-30.(in Chinese)

[17]李铁柱,杜红岩,刘慧敏,等.杜仲幼果和成熟果实转录组数据组装及基因功能注释 [J].中南林业科技大学学报(自然科学版),2012,32(10):9-17.

Li T Z,Du H Y,Liu H M,et al.Transcriptome data assembly and gene function annotation ofEucommiamaturefruits and young fruits [J].Journal of Central South University of Forestry & Technology (Nat Sci Ed),2012,32(10):9-17.(in Chinese)

[18]Mortazavi A,Williams B A,Mccue Kenneth,et al.Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq [J].Nat Methods,2008,5(7):621-628.

[19]王淋,乌云塔娜,叶生晶.杜仲成熟果实和幼果 MVA 途径基因表达差异分析 [J].经济林研究,2013,31(4):45-51.

Wang L,Wuyun T N,Ye S J.Analysis on gene differential expression in ripe and young fruits ofEucommiaulmoidesby MVA pathway [J].Nonwood Forest Research,2013,31(4):45-51.(in Chinese)

[20]张琳，谭晓风，胡娇,等.油茶乙酰CoA酰基转移酶基因cDNA克隆及序列特征分析 [J].中南林业科技大学学报(自然科学版),2011,31(8):108-112.

Zhang L,Tan X F,Hu J,et al.Cloning and sequence characterization of cDNA encoding acety-lCoAC-acetyl transferase inCamelliaoleifera[J].Journal of Central South University of Forestry & Technology(Nat Sci Ed),2011,31(8):108-112.(in Chinese)

[21]王计平,史华凭,李润植.植物种子油合成的调控与遗传修饰 [J].植物遗传资源学报,2007,7(4):488-493.

Wang J P,Shi H P,Li R Z.Regulation and genetic modification of seed oil synthesis in plants [J].Journal of Plant Genetic Resources,2007,7(4):488-493.(in Chinese)

[22]Mortazavi A,Williams B A,Mccue K,et al.Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq [J].Nat Methods,2008,5(7):621-628.

[23]郑清平,余龙江,刘智,等.红豆杉细胞非甲羟戊酸途径关键酶基因dxr的克隆与分析 [J].生物工程学报,2004,7(20):548-553.

Zheng Q P,Yu L J,Liu Z,et al.Cloning and analys is of cDNA encoding key enzyme gene (dxr) of the non-MVA pathway inTaxuschinensiscells [J].Chinese Journal of Biotechnology,2004,7(20):548-553.(in Chinese)

[24]Wititsuwannakul R,Wititsuwannakul D,Suwanmanee P.Purification and characterization of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase from latex of Hevea [J].Phytochem,1990,29:1401-1403.

[25]Chappell J,Wolf F,Proulx J,et al.Is the reaction catalyzed by 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase a rate-limiting step for isoprenoid biosynthesis in plant [J].Plant Physiol,1995,109:1337-1343.

[26]Ren Chen,Yoko Harada,Takeshi Bamba,et al.Overexpression of an isopentenyl diphosphate isomerase gene to enhance trans-polyisoprene production inEucommiaulmoidesOliver [J].BMC Biotechnology，2012,12:78.

Differential expression of MVA pathway genes in young fruits and leaves ofEucommiaulmoidesOliver

WANG Lin1,2,WUYUN Ta-na1,2,YE Sheng-jing3

(1Non-timberResearchandDevelopmentCenterofCAF,Zhengzhou,Henan450003,China;2TheEucommiaEngineeringResearchCenterofStateForestryAdministration,Zhengzhou,Henan450003,China;3CentralSouthForestInventoryandPlanningInstituteofStateForestryAdministration,Changsha,Hunan410014,China)

Abstract:【Objective】 Eucommia ulmoides Rubber (EuR) is one type of terpenoids,which can be synthesized by mevalonate (MVA) pathway.This study analyzed the differential expression of genes in MVA pathway in young fruits and leaves of E.ulmoides oliver and predicted main pathways of EuR synthesis.【Method】 According to the high-throughput transcriptome sequencing (RAN-seq) data,functional annotation and expression analysis in E.ulmoides young fruits and leaves,unigenes of MVA pathway were determined,and their expressions were systematically analyzed.【Result】 Twenty-three unigenes in MVA pathway were annotated including 3 acetyl-CoA C-acetyltransferase (EuACTO),3 hydroxymethylglutaryl-CoA synthase (EuHMGS),8 hydroxymethylglutaryl-CoA reductase (EuHMGR),2 mevalonate kinase (EuMK),1 phosphomevalonate kinase (EuPMK),and 6 diphosphomevalonate decarboxylase (EuMDP).Reads Per Kilo bases per Million reads (RPKM) data analysis showed that the expressions of EuACOT8,EuACOT10,EuHMGS4,EuHMGS5,EuHMGS6,EuHMGR18,EuMK3,EuMK4,EuMDP7,EuMDP8,EuMDP9,EuMDP10,and EuMDP11 were significantly different in young fruits and leaves.Only the expression of EuMDP9 in leaves was greater than in young fruits,while the expressions of other genes in young fruits were greater than in leaves.Furthermore,EuHMGR15 and EuHMGR17 were unique in young fruits.【Conclusion】 Most of genes in MVA pathway were abundantly expressed in young fruits,which was consistent with the fact that rubbers form fruits were more than from leaves.Therefore,MVA pathway was considered the main synthetic pathway of EuR.

Key words：Eucommia ulmoides Olives;young fruits and leaves;MVA pathway;differential expression of gene

DOI：网络出版时间:2016-04-0709:0010.13207/j.cnki.jnwafu.2016.05.013

[收稿日期]2014-09-29

[基金项目]国家林业公益性行业科研专项(201004029)

[作者简介]王淋(1986-)，女，辽宁鞍山人，博士，主要从事经济林育种研究。E-mail：174816279@qq.com[通信作者]乌云塔娜(1975-)，女，内蒙古通辽人，教授，主要从事经济林育种栽培研究。E-mail：tanatanan@163.com

[中图分类号]Q786

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)05-0097-08

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160407.0900.026.html