凤丹胚乳内源抑制物质活性及其成分的GC-MS鉴定

孙晓刚，丁　言，郭太君，马　赛

(吉林农业大学 园艺学院，吉林 长春 130118)



凤丹胚乳内源抑制物质活性及其成分的GC-MS鉴定

孙晓刚，丁言，郭太君，马赛

(吉林农业大学 园艺学院，吉林 长春 130118)

[摘要]【目的】 研究凤丹种子胚乳中内源抑制物质活性及其成分组成,为了解其休眠机理提供参考。【方法】 采用系统溶剂分离法，分离萃取凤丹胚乳中的内源抑制物质，对4种有机溶剂(石油醚、乙酸乙酯、乙醚、甲醇)萃取液和水相进行白菜种子发芽试验，确定发挥抑制作用的优势组分，并对其成分进行GC-MS分析。【结果】 凤丹种子胚乳各有机溶剂萃取液对白菜种子发芽率和幼苗苗高生长、根长生长均有不同程度的抑制作用，但抑制物质活性存在一定差异。4种有机溶剂萃取液中抑制作用最强的是乙醚组分，其次是甲醇组分，再次是乙酸乙酯组分。利用GC-MS方法从乙醚组分中共检出6种物质，主要为乙酸(66.661%)、甲酸(25.996%)、乙酐(2.399%)、苯酚(2.217%)等；从乙酸乙酯组分中共检出11种物质，主要为乙酸(56.343%)、甲酸(14.772%)、DL-3-乙基乙酸丁酸酯(6.266%)、乙酐(4.834%)等；从甲醇组分中共检出33种物质，主要为苯甲酸(32.631%)、1,3-二羟基丙酮(10.997%)、5-羟甲基糠醛(8.964%)、乙酸(5.751%)等；这些物质中被证实有抑制活性的是乙酸和苯甲酸；GC-MS检出物主要为有机酸类、酮类、酯类和醛类等，不同组分中相对含量高的均为有机酸类物质。【结论】 乙醚萃取液中的化合物可能是导致凤丹种子萌发受抑制的主要物质。

[关键词]凤丹；胚乳；内源抑制物质；GC-MS

凤丹(PaeoniaostiiT.Hong et J.X.Zhang)即铜陵牡丹[1]，是著名的药用牡丹品种，主要分布在安徽铜陵凤凰山一带，是安徽道地药材凤丹皮的原植物，具有很高的栽培价值[2]。凤丹主要以种子繁殖为主，但由于种子具有很长的休眠期和典型的休眠特性[3-5]，因此在自然情况下种子萌发率很低，这使凤丹种苗生产受到较大限制。植物种子休眠的一个主要原因是在种子的不同部位中存在抑制物质[6]。如从种皮、果皮、胚乳和胚中能分离出某些化合物,这些物质的存在阻碍了种子生理活动的某个代谢环节,从而影响了种子发芽过程的进行[7]。

张艳杰[8]、韩宝瑞等[9]、杨晓玲等[10]采用系统溶剂分离法分别对南方红豆杉种子、西洋参果实和山楂种子的浸提液进行分离，发现抑制物质主要存在于种子的乙醚萃取液和甲醇萃取液中。周仁超等[11]研究发现，紫斑牡丹种子中含有某些影响种子后熟和发芽的化学物质，导致种子休眠。但目前有关影响凤丹种子发芽过程生理代谢的化学物质及其组成却鲜有报道。因此，本试验采用系统溶剂分离法对凤丹种子胚乳的内源抑制物质进行萃取，并对各有机溶剂萃取液进行生物测定，选取活性最强的组分，用GC-MS对胚乳中的主要物质进行鉴定，以期为进一步研究凤丹种子内源抑制物质及其休眠机理提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料

供体材料为凤丹当年种子，购自河南省洛阳市土桥花木种苗有限公司。种子千粒质量为296.0 g。 受体材料为白菜种子，均为市售，纯度95%,净度98%,发芽率85%以上,含水量约8%。

1.2方法

1.2.1凤丹胚休眠特性的检验选取饱满的凤丹种子，采用浸种法去除上浮的不充实种子，留下饱满种子待用。供试种子在室温下浸泡24 h，使种子充分吸水膨胀，流水下冲洗30 min后在超净工作台上用体积分数70%乙醇消毒30 s，用无菌水冲洗3次，再用质量分数0.1%的升汞消毒8 min，无菌水冲洗5次，在超净工作台上分离出种胚并接种于培养基上，培养条件为温度(25±2) ℃，光照强度 1 000 lx,光照时间12 h/d。30个胚，3次重复，30 d后统计各处理种子萌发数量。

1.2.2凤丹胚乳中内源抑制物质的萃取与分离将饱满种子胚乳研磨后取10 g置于三角瓶内，加入体积分数80%甲醇溶液使胚乳完全浸没，4 ℃密闭浸提，定期搅拌使其充分浸提，每隔24 h将浸提液真空抽滤，收集滤液后再重新加入体积分数80%甲醇溶液浸提，重复数次直至浸提液颜色变浅为止，再将所有滤液混合。

采用系统溶剂分离法[12]对上述胚乳甲醇浸提液进行初步分离,分离流程如图1所示。将浸提液分离成5种组分：石油醚组分、乙醚组分、乙酸乙酯组分、甲醇组分和水组分。将胚乳的各有机溶剂提取液用高速离心机于4 000 r/min离心5 min，收集上清液，真空抽滤，滤液分别置于旋转蒸发仪上减压浓缩至50 mL(即得质量浓度0.2 g/mL的浓缩液)，然后用塑料薄膜封住瓶口，置于4 ℃冰箱中保存待用。

1.2.3白菜种子处理在35 ℃水浴条件下,将白菜种子用质量分数0.5%高锰酸钾溶液浸泡消毒30 min，蒸馏水洗净残留高锰酸钾溶液后选出籽粒饱满的种子，风干待用。

1.2.4不同溶剂相中抑制物质活性的测定取胚乳各有机溶剂萃取液3 mL，分别加入垫有2层滤纸的直径9 cm培养皿中(48 h内定时补给蒸馏水确保水分充足)，以相同体积蒸馏水处理为对照。每处理重复3次，每个重复30粒白菜种子，在25 ℃恒温光照培养箱内进行白菜籽发芽试验。48 h后统计发芽(以胚根长大于种子长的1/2为发芽标准)数量,计算发芽率,72 h后测量苗高和主根长，96 h后统计侧生根数量和侧生根长度。

1.2.5抑制作用优势组分的鉴定根据1.2.4节的测定结果，从抑制活性物质中选取强活性组分，采用GC-MS分析鉴定其具体组成。仪器为：Agilent 6890N 气相色谱-质谱联用仪。气相色谱条件：WAX石英毛细管柱6 m×0.25 cm×0.25 mm,柱温60～250 ℃,程序升温10 ℃/min,载气为氦气，气化室温度为250 ℃。质谱条件：离子源EI,源温230 ℃，电离电压70 eV，20～450 amu扫描。GC-MS分析图谱经计算机数据系统检索并与Nist2008标准谱图对比，再进行人工分析，以确定各组分的结构和名称；以鉴定图谱中每个峰面积与总峰面积的比值代表该成分在所测有机化合物中的相对含量。

图 1凤丹种子内源抑制物质的系统溶剂分离流程

Fig.1Separation system of endogenous inhibitory substances from seeds ofPaeoniaostii1.3数据分析

采用SPSS18.0软件对试验数据进行方差分析和多重比较。

2结果与分析

2.1凤丹胚休眠特性的检验

对凤丹离体胚进行组织培养，结果发现，在整个培养过程中，所有供试凤丹种子的外植体充分吸胀，子叶转为淡绿色，均有萌发成苗的现象。表明本试验所用的凤丹种子种胚本身无休眠特性。

2.2凤丹胚乳各有机溶剂萃取组分对白菜种子发芽的影响

由表1可知，与对照相比，用凤丹种子胚乳石油醚组分、乙醚组分、乙酸乙酯组分、甲醇组分和水相处理的白菜种子发芽率，分别降低了35.60%，68.90%，40.00%，41.10%和36.70%，且差异均达到极显著水平，说明凤丹胚乳有机溶剂各组分萃取液对白菜种子发芽均存在一定的抑制作用，且乙醚组分的抑制作用最强。除乙醚组分处理外，其他各组分处理之间无显著差异。各有机溶剂萃取液对白菜种子发芽的抑制作用大小为：乙醚>甲醇>乙酸乙酯>水>石油醚。

表 1　凤丹胚乳各有机溶剂萃取组分对白菜种子发芽与幼苗生长的影响

注：同列数据后标不同大写字母表示在α=0.01水平上差异极显著,标不同小写字母表示在α=0.05水平上差异显著。

Note： Different capital letters represent extremely significant difference atα=0.01 level，while lowercase letters represent significant difference atα=0.05 level.

2.3凤丹胚乳各有机溶剂萃取组分对白菜幼苗生长的影响

2.3.1主根长由表1可知，凤丹种子胚乳石油醚组分处理的白菜幼苗主根长与对照相比无显著差异；乙醚组分、乙酸乙酯组分、甲醇组分和水相处理的白菜幼苗主根长均极显著低于对照，且这4个处理间无显著差异。各有机溶剂组分对白菜主根长生长的抑制作用大小顺序为：乙醚>甲醇>乙酸乙酯>水>石油醚。

2.3.2苗高由表1可知，凤丹种子胚乳石油醚组分处理的白菜苗高与对照相比无显著差异，其他各组分均显著或极显著小于对照，说明有机溶剂各组分萃取液对白菜种子发芽有一定的抑制作用，且以乙醚组分的抑制作用最强，除乙醚组分外的其余4个处理间无显著差异。各有机溶剂组分对白菜幼苗苗高的抑制作用大小顺序为：乙醚>甲醇>乙酸乙酯>水>石油醚。

2.3.3侧生根数量和长度由表1可知，凤丹种子胚乳石油醚组分、乙酸乙酯组分和水相处理的白菜幼苗侧生根数量与对照相比无显著差异，而甲醇组分处理的白菜幼苗侧生根数量与对照相比降低了69.69%，各有机溶剂组分对白菜幼苗侧生根萌生的抑制作用大小顺序为：乙醚>甲醇>乙酸乙酯≥水>石油醚。 由表1还可知，凤丹种子胚乳乙醚组分处理的白菜幼苗未萌生侧生根，除石油醚组分外，其他各处理侧生根长度均显著或极显著低于对照。各有机溶剂组分对白菜幼苗侧生根长度的抑制作用大小顺序为：乙醚>乙酸乙酯>甲醇>水>石油醚。

以上结果表明，凤丹种子胚乳各不同有机溶剂组分对白菜种子萌发和幼苗生长均有不同程度的抑制作用，其中以石油醚组分的抑制作用最弱，乙醚组分的抑制作用最强，其次是甲醇组分，再次是乙酸乙酯组分。

2.4凤丹种子内源优势抑制活性组分成分的鉴定

2.4.1乙醚组分中各成分的鉴定利用GC-MS鉴定了凤丹种子胚乳乙醚组分萃取液的主要成分，从中共分离出15个峰，将各峰经质谱扫描后的质谱图，用质谱计算机数据系统检索并与标准图谱进行核对,从离子流程图(图2)中选择出峰面积和相似度较大的有机化合物6种(表2)。

图 2　凤丹胚乳乙醚组分的GC-MS鉴定图谱

来源Origin保留时间/minRetentiontime分子式Molecularformula有机化合物Organiccompound相对含量/%Relativecontent乙醚组分Ethylethercomponents9.416C4H6O3乙酐Aceticanhydride2.39912.029C2H4O2乙酸Aceticacid66.66112.734CH2O2甲酸Formicacid25.99613.092C7H16O2-乙氧基戊烷2-Ethoxypentane0.93214.224C8H8O2苯甲酸甲酯Benzoicacid,methylester1.79517.603C6H6O苯酚Phenol2.217乙酸乙酯组分Ethylacetatecomponents9.417C4H6O3乙酐Aceticanhydride4.83411.559C6H14O2乙二醇单丁醚Ethanol,2-butoxy0.71811.751C4H8O3羟基乙酸乙酯Hydroxyaceticacidethylester0.65212.047C2H4O2乙酸Aceticacid56.34312.395C5H10O21-丙酯乙酸Aceticacid,1-methylethylester1.90712.465C8H14O42,3-二乙基丁二酸2,3-Butanedioldiacetate4.60812.743CH2O2甲酸Formicacid14.77213.484C8H14O4DL-3-乙基乙酸丁酸酯Ethyl(+-)-3-acetoxybutyrate6.26614.006C12H24O618-冠-6-醚18-Crown-6-ether2.78714.215C8H8O2苯甲酸甲酯Benzoicacid,methylester1.69614.520C8H14O4丁二酸二乙酯Diethylsuccinate1.202甲醇组分Methanolcomponents9.983C5H6N22-甲基嘧啶2-Methylpyrimidine0.18910.470C3H6O2羟基丙酮1-hydroxy-2-Propanone2.42910.845C3H6O31,3-二羟基丙酮1,3-Dihydroxy-2-propanone10.99712.090C2H4O2乙酸Aceticacid5.75112.221C4H6O3丙酸-2-氧-甲酯Propanoicacid,2-oxo-,methylester1.99712.447C5H4O23-糠醛3-Furaldehyde1.18412.778CH2O2甲酸Formicacid3.35113.727C6H6O25-甲基-2-糖醛5-methyl-2-Furancarboxaldehyde0.11913.910C5H4O22-环戊烯-1,4-二酮2-Cyclopentene-1,4-dione0.18414.102C3H4O22-丙烯酸2-Propenoicacid0.21214.389C5H6O22-呋喃甲醇2-Furanmethanol2.84214.502C4H6O2丁内酯Butyrolactone0.95914.955C6H8O25-甲基-2-呋喃甲醇5-methyl-2-Furanmethanol0.18115.182C5H4O33-甲基-2,5-呋喃二酮3-methyl-2,5-Furandione0.33915.626C5H6O22-羟基-2-环戊烯-1-酮2-Cyclopenten-1-one,2-hydroxy0.84215.626C5H6O21,2-环戊二酮1,2-Cyclopentanedione0.84215.730C4H4O22(5H)-呋喃酮2(5H)-Furanone0.35817.498C6H6O3甲基麦芽酚Maltol0.76917.594C6H6O苯酚Phenol0.37617.646C5H4O32H-吡喃-2,6(3H)-二酮2H-Pyran-2,6(3H)-dione0.37017.838C6H8O34-羟基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮2,5-Dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone0.95818.726C4H8O羟甲基环丙烷Cyclopropylcarbinol3.19519.231C4H6O32-羟基-丁酸酮2-Hydroxy-gamma-butyrolactone2.19219.919C6H8O42,3-二氧-3,5-二羟-6-甲基-4H-吡喃-4-酮4H-Pyran-4-one,2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl1.98620.572C4H10N2ON-亚硝基-N-甲基-N-丙胺N-methyl-N-nitroso-2-Propanamine1.04321.182C7H6O2苯甲酸Benzoicacid32.63121.983C6H6O35-羟甲基糠醛5-(hydroxymethyl)-2-Furancarboxaldehyde8.96422.166C10H16O22-羟基-6-甲基-3-(1-甲乙基)-2-环己烯-1-酮2-hydroxy-6-methyl-3-(1-methylethyl)-2-Cyclohexen-1-one1.24923.255C4H6O3(+/-)-3-羟基-r-丁内酯dihydro-4-hydroxy-2(3H)-Furanone0.89926.782C16H32O2n-十六酸n-Hexadecanoicacid0.91632.738C18H34O2顺式-十八碳烯酸trans-13-Octadecenoicacid1.15434.602C18H32O2亚麻酸Linoleicacid0.814

由表2可知，6种有机化合物中相对含量较高的物质依次为：乙酸(66.661%)、甲酸(25.996%)、乙酐(2.399%)、苯酚(2.217%)、苯甲酸甲酯(1.795%)，其他成分的相对含量都在1%以下。

2.4.2乙酸乙酯组分中各成分的鉴定利用GC-MS鉴定凤丹种子胚乳乙酸乙酯组分萃取液的主要成分，从中共分离出16个峰，将各峰经质谱扫描后的质谱图，用质谱计算机数据系统检索并与标准图谱进行核对,从离子流程图(图3)中选择出峰面积和相似度较大的有机化合物11种(表2)。其中相对含量较高的物质依次为：乙酸(56.343%)、甲酸(14.772%)、DL-3-乙基乙酸丁酸酯(6.266%)、乙酐(4.834%)、2,3-二乙基丁二酸(4.608%)、18-冠-6-醚(2.787%)、1-丙酯乙酸(1.907%)、苯甲酸甲酯(1.696%)、丁二酸二乙酯(1.202%)，其他成分的相对含量都在1%以下。

图 3凤丹胚乳乙酸乙酯组分的GC-MS鉴定图谱

Fig.3GC-MS spectrum of ethyl acetate components inPaeoniaostiiendosperm

2.4.3甲醇组分中各成分的鉴定利用GC-MS鉴定凤丹种子胚乳甲醇组分萃取液的主要成分，从中共分离出38个峰，将各峰经质谱扫描后的质谱图，通过质谱计算机数据系统检索并与标准图谱进行核对,从离子流程图(图4)中选择出峰面积和相似度较大的有机化合物33种(表2)。其中相对含量较高的物质依次为：苯甲酸(32.631%)、1,3-二羟基丙酮(10.997%)、5-羟甲基糠醛(8.964%)、乙酸(5.751%)、甲酸(3.351%)、羟甲基环丙烷(3.195%)、2-呋喃甲醇(2.842%)、羟基丙酮(2.429%)、2-羟基-丁酸酮(2.192%)、丙酸-2-氧-甲酯(1.997%)、2,3-二氧-3,5-二羟-6-甲基-4H-吡喃-4-酮(1.986%)、2-羟基-6-甲基-3-(1-甲乙基)-2-环己烯-1-酮(1.249%)、3-糠醛(1.184%)、顺式-十八碳烯酸(1.154%)、N-亚硝基-N-甲基-N-丙胺(1.043%),其他成分的相对含量都在1%以下。

图 4　凤丹胚乳甲醇组分的GC-MS鉴定图谱

3讨论

植物种子中含有一些化学物质，这些物质通过阻碍种子吸水、抑制呼吸、抑制酶活性、阻碍种胚生长等,对种子萌发起抑制作用[13]。要确定这类化学物质是否存在，通常采用提取其成分并对非休眠植物种子做生物测定来判断。本试验通过凤丹离体胚萌发试验证实，所用种子种胚本身无休眠特性，用系统溶剂法分离凤丹胚乳中内源抑制物质，并测定其生物活性，结果表明，胚乳中各有机溶剂组分对白菜种子发芽、苗高、根长生长和侧生根生长均有一定的抑制作用，抑制作用最强的是乙醚组分，其次是甲醇组分，这与前人研究结果[8-9]基本一致。由此可推断，凤丹胚乳乙醚萃取液和甲醇萃取液中存在某些萌发抑制物质，且这些物质对白菜种子萌发和生长的抑制活性较强。但这些物质具体在种子萌发过程的哪个阶段发挥抑制作用还有待进一步研究。

覃逸明等[14]在连续种植4年的栽培牡丹凤丹(P.ostiiT.)根际中发现至少5种以上的酚酸类物质(阿魏酸、肉桂酸、香草醛、香豆素和丹皮酚)。杨勇等[15]研究了四川牡丹(PaeoniadecompositaHand.-Mazz.)胚乳浸提液对油菜种子与幼苗生长的影响，推测四川牡丹胚乳中的内源抑制物质可能是有机酸和酚类物质。宋会兴等[16]研究了四川牡丹种子内源抑制物质的活性，推测四川牡丹种子胚乳浸提液中可能含有多酚类化合物，这些物质影响了受体白菜幼苗保护酶的活性。周理平等[17]研究了紫斑牡丹种子浸提液对油菜种子萌发的影响，发现紫斑牡丹种子中含有某些影响油菜种子发芽的物质。但这些研究均未对牡丹种子中的抑制物质做进一步的分离鉴定，也未对牡丹种子中抑制物质所在部位及其抑制物质活性做系统深入的研究。本试验采用系统溶剂分离与GC-MS鉴定相结合的方法，从凤丹种子胚乳抑制作用优势组分中分离鉴定出多种化合物质，主要为有机酸类、酮类、酯类、醛类、酚类、醇类等。其中有机酸类化合物有11种，相对含量较高的为乙酸、甲酸、苯甲酸等；酯类化合物有7种，相对含量较高的为1,3-二羟基丙酮、DL-3-乙基乙酸丁酸酯、丙酸-2-氧-甲酯、苯甲酸甲酯、丁二酸二乙酯等；酮类化合物有12种，相对含量较高的为羟基丙酮、2-羟基-丁酸酮等；醛类化合物有3种，为5-羟甲基糠醛、3-糠醛、5-甲基-2-糖醛；酚类化合物有2种，为苯酚、甲基麦芽酚；醇类化合物有2种，为2-呋喃甲醇、5-甲基-2-呋喃甲醇；醚类化合物2种和烷烃类化合物2种及1种胺类化合物。在这些化合物中仅乙酸和苯甲酸的萌发抑制活性已被证实[18-19]，其他化合物的萌发抑制活性及其与种子休眠的关系需要采用标准品鉴定进一步证实。依据本试验中生物活性测定结果，可推断乙醚萃取液中鉴定出的化合物可能是导致凤丹种子萌发过程受抑制的主要物质。

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Activities and GC-MS identification of endogenous inhibitory substances in endosperm ofPaeoniaostii

SUN Xiao-gang，DING Yan，GUO Tai-jun，MA Sai

(CollegeofHorticulture,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

Abstract：【Objective】 This paper studied activities and components of inhibitory substances in seed endosperm of Paeonia ostii to understand the dormancy mechanism.【Method】 System solvent separation was used to extract endogenous inhibiting substances in endosperm of P.ostii with four organic solvents (petroleum ether,ethyl acetate,ethyl ether,methanol) and water,and seed germination of Chinese cabbage was tested.Then,the dominant components of inhibitory substances were determined using GC-MS analysis.【Result】 The seed germination rate and height and root length of seedling of Chinese cabbage were inhibited by organic solvent extracts of inhibitory substances in seed endosperm of P.ostii.There were differences in the inhibition effects with a decreasing order of ethyl ether>methanol>ethyl acetate>petroleum ether.Six substances including acetic acid (66.661%),formic acid (25.996%),acetic anhydride (2.399%),and phenol (2.217%) were detected by GC-MS from ether extract.Eleven were detected from ethyl acetate extract including acetic acid (56.343%),formic acid (14.772%),ethyl (+-)-3-acetoxybutyrate (6.266%),and acetic anhydride (4.834%).Thirty-three substances including benzoic acid (32.631%),1,3-dihydroxy-2-propanone (10.997%),5-(hydroxymethyl)-2-Furancar-boxaldehyde (8.964%),and acetic acid (5.751%) were obtained from methanol extract.The substances with inhibitory effects were acetic acid and benzoic acid.【Conclusion】 The compounds identified in the ether extract may be the main substances inhibiting seed germination of P.ostii.

Key words:Paeonia ostii;endosperm;inhibitory substance;GC-MS

DOI：网络出版时间:2016-04-0709:0010.13207/j.cnki.jnwafu.2016.05.024

[收稿日期]2015-03-24

[基金项目]吉林省科技发展计划项目(2013020607NY)

[作者简介]孙晓刚(1969-)，男，吉林长春人，副教授，硕士，硕士生导师，主要从事园林规划设计及园林植物配置与应用研究。E-mail:120082055@qq.com

[中图分类号]S685.110.4+1

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)05-0177-08

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160407.0900.048.html