猪小肠抗菌肽Cecropin P1对猪呼吸道菌抑菌活性的研究

李伦锋，魏建超，谢春阳，彭 帅，李蓓蓓，刘 珂，邵东华，邱亚峰，史子学，马志永

（1. 吉林农业大学 食品科学与工程学院，长春 130000；2. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；3. 上海市嘉定区农业委员会，上海 201800）



猪小肠抗菌肽Cecropin P1对猪呼吸道菌抑菌活性的研究

李伦锋1,2，魏建超2，谢春阳1，彭 帅1，李蓓蓓2，刘 珂2，邵东华2，邱亚峰2，史子学3，马志永2

（1. 吉林农业大学 食品科学与工程学院，长春 130000；2. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；3. 上海市嘉定区农业委员会，上海 201800）

摘 要：以猪链球菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪支气管败血波氏杆菌、猪致病性大肠杆菌、化脓性链球菌7株猪呼吸道常见菌为实验菌，检测猪小肠抗菌肽对常见的猪呼吸道菌的抑菌效果。结果显示，猪小肠抗菌肽对这7株呼吸道菌均有不同程度的抑菌作用，对化脓性链球菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌作用最为明显，最小抑菌浓度均为49.5 μg/mL，对猪链球菌和大肠杆菌也有较为明显的抑菌活性，而对猪支气管败血波氏杆菌的最小抑菌浓度为398 μg/mL。当前在抗生素大量使用导致细菌产生广泛的耐药性的情况下，抗菌肽以其具有抗菌谱广、无毒、稳定性高、不易产生耐药性且在体内无残留等优点，使抗菌肽抑菌活性的研究显得尤为重要。

关键词：猪小肠抗菌肽；抑菌活性；最小抑菌浓度

抗菌肽（antibacterial peptide，ABP）是生物体重要的天然免疫介质，是动物体吞噬细胞和黏膜上皮细胞的主要杀菌分子，具有抗菌谱广、无毒、稳定性高、不易产生耐药性等优点，近年来逐渐被广大研究者所关注[1,2]。猪呼吸道菌的感染是引起猪呼吸道病综合征主要途径之一。胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，App）和多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）是猪呼吸道常见的重要致病菌，均可导致或者继发于其他病原感染，给养猪业造成严重的经济损失[3]。原发和继发的细菌性呼吸道病是造成猪大量死亡的重要原因，而大多数呼吸道菌对抗菌药物已表现出耐药性[4,5]。因此，探究新型的不易产生耐药性的抗菌药物显得尤为重要。本研究主要通过检测抗菌肽对常见猪呼吸道菌的体外抑菌活性，为新型抗菌药物的研发提供科学依据。

1　材料与方法

1.1菌株 毕赤酵母菌由本实验室保存；实验菌种：猪链球菌、金黄色葡萄球菌（ATCC29213）、化脓性链球菌、多杀性巴氏杆菌（实验室分离鉴定的3株菌，编号为1～3）、猪胸膜性肺炎放线杆菌（实验室分离鉴定的11株菌，编号为1～11）、猪支气管败血波氏杆菌和大肠杆菌（EHEC0157030）均由本实验室分离鉴定保存。

1.2试剂 氨苄青霉素、卡那霉素购自Sigma公司；酵母膏、蛋白胨、右旋葡萄糖、山梨酸醇、生物素、YNB、甲醇、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化钠分析纯购自北京天根生物科技有限公司。碧云天BCA试剂盒购自北京奇虎科技有限公司。

1.3抗菌肽的制备 取毕赤酵母菌接种于4 mL（含100 μg/mL zeocin）的YPDS液体培养基（酵母膏1%、蛋白胨2%、右旋葡萄糖2%、山梨酸醇 18.22%）中，29℃、300r/min摇床过夜取OD600为1的菌种100 μL接种在5 mL BMGY 培养基（1%酵母膏、2%蛋白胨、l%甘油、0.4 mg/L生物素、1.34%YNB、100 mol/L磷酸盐缓冲液）中，29℃、300 r/min摇床培养24 h，3214×g，离心10 min，将沉淀菌体重悬至25 mL BMMY液体培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.5%甲醇、0.4mg/L生物素、1.34%YNB、100 mol/L磷酸盐缓冲液）中，29℃、300 r/min摇床培养，每24 h补加0.5%的甲醇，72 h时，12857×g，离心10 min离心收集上清，用0.22 μL滤膜过滤，得到粗制的猪小肠抗菌肽[6]；同时按上述方法培养X33空载体，0.22 μm滤膜过滤得到上清备用。

1.4抑菌活性检测-琼脂扩散试验[7]将实验菌株均配制成106cfu/mL菌悬液，配制TSA固体培养基（1.5%胰蛋白胨、0.5%大豆蛋白胨、0.5%氯化钠、1.5%琼脂糖），高压冷却至55℃左右，将菌种和培养基按1:100混合，轻轻晃动至菌种培养基混合均匀后倒入直径为10 cm的培养皿，厚度为1.5cm，待凝固后打梅花孔，将抗菌肽、氨苄青霉素（100μg/mL）和卡那霉素（50 μg/mL）（阳性对照）以30 μL/孔加至孔中，37℃培养24 h后，通过检测抑菌圈直径来确定其抑菌活性。

1.5测定抗菌肽对猪呼吸道菌的抑菌作用

1.5.1检测抗菌肽浓度 按碧云天BCA试剂盒说明书进行检测[8]。同时检测X33空载体表达的上清浓度和抗菌肽浓度，抗菌肽浓度=抗菌上清浓度-X33上清浓度。

1.5.2抗菌肽抗菌活性的检测。复苏细菌后按上述1.4的方法进行检测。

1.5.3抗菌肽对实验菌株的最小抑菌浓度（微量肉汤稀释法检测） 取8支装有4 mL MH肉汤培养基（牛肉浸粉 5%、酪蛋白水解物 17.5%、淀粉 1.5%）的试管，分别将实验菌接种到试管中，37℃、180 r/ min，摇床16 h进行细菌增殖。将得到的猪小肠抗菌肽通过0.22 μL滤膜过滤后，依次进行倍比稀释，共稀释10个梯度，置于EP管内。将稀释好的抗菌肽各取10 μL加入96孔板中，氨苄青霉素和培养基作为对照。将增殖后的菌液稀释至5×105CFU/mL，每行一株菌种取90 μL加至96孔板中，混合均匀后放入37℃培养箱中18 h，观察并记录实验结果，平行重复3次，取平均值[9]。

2　结果

2.1重组猪小肠抗菌肽的抗菌活性检测 毕赤酵母表达得到的猪小肠抗菌肽琼脂扩散结果显示：1、2、3孔有明显的抑菌圈，说明毕赤酵母表达得到的抗菌肽具有较高的生物活性；猪小肠抗菌肽、卡那霉素、氨苄青霉素在剂量等同的条件下具有相对较高的抗菌活性，猪小肠抗菌肽对常见猪呼吸道菌有明显的抑制或杀灭作用；5、6分别表示X33空载体和毕赤酵母培养基BMMY无抑菌圈，排除了培养基和抗菌肽不纯对实验结果的影响。

图1　抗菌肽Cecropin P1抑菌活性检测Fig. 1 Results on the antibacterial activity of Cecropin P1a: 猪链球菌; b: 胸膜性肺炎放线杆菌; c: 猪支气管败血波氏杆; d: 化脓性链球菌; e: 多杀性巴氏杆菌; f: 金黄色葡萄球菌; g: 大肠杆菌2、3: 卡那霉素、氨苄青霉素; 1、4、7: 猪小肠抗菌肽样品、样品稀释101、样品稀释102; 5、6: X33空载体、毕赤酵母培养基BMMYa: Streptococcus suis; b: Actinobacillus pleuropneumoniae; c: Swine bordetella bronchiseptica; d: Streptococcus pyogenes; e: Pasteurella multocida; f: Staphylococcus aureus; g: Swine enteropathogenic E.coli2, 3: The positive control of kanamycine and ampicillin; 1, 4 ,7: Swine intestine's antibacterial peptide, 10 times diluted sample, 100 times diluted sample, respectively; 5, 6: X33 non-carrier and pichia medium BMMG

2.2抗菌谱的测定结果 琼脂扩散实验3次平行结果显示：猪小肠抗菌肽对常见猪链球菌（Ss）、多杀性巴氏杆菌（Pm）、猪胸膜肺炎放线杆菌（App）、化脓性链球菌（Sp）、猪致病性大肠杆菌（EHEC0157030）金黄色葡萄球菌（ATCC29213）等自然分离株均有明显的杀灭或抑制作用。对猪支气管败血波氏杆菌（Bb）的抑菌作用稍弱（表1）。

表1 猪小肠抗菌肽的抗菌谱测定Table 1 Determination of antibacterial spectrum of antibacterial peptides

2.3微量肉汤稀释法检测猪小肠抗菌肽对实验菌株的最小抑菌浓度结果 通过BCA法检测毕赤酵母表达得到的粗制猪小肠抗菌肽的浓度为15.935mg/mL，以抗菌肽的初始浓度进行倍比稀释，微量肉汤稀释法检测结果显示，猪小肠抗菌肽对化脓性链球菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度相对较低，说明只要较低浓度的抗菌肽就可以杀灭这3株菌，验证了抗菌肽具有较高的的抑菌或杀菌活性；对猪链球菌和大肠杆菌的抑菌效果弱于化脓性链球菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌，但也有较为明显的抑菌活性；而对猪支气管败血波氏杆菌的最小抑菌浓度为389.3 μg/mL，相对较高，说明抗菌肽对猪支气管败血波氏杆菌抑菌作用不明显（表2）。

表2 猪小肠抗菌肽对实验菌株的最小抑菌浓度Table 2 Minimal inhibitory concentration of porcine small intestinal antibacterial peptides Cp 1 against 7 bacterial

3　讨论

抗菌肽的整个发展过程经历了相当长的一段时间，至今为止人们对其精确的抗菌机理和分子水平方面研究较少，导致其优良的特性至今仍无法应用于临床。近年来人们对抗菌肽的研究越来越重视：一方面，将抗菌肽作为抗菌药物来代替抗生素，以此来弥补抗生素易产生耐药性的不足[10]；另一方面，在分子水平上研究其在机体免疫防御系统中的合成过程及其作用机制[11]；其次，抗菌肽的高抗菌活性、无细菌耐药性及其对正常细胞无伤害的特性，使其具有巨大的药用价值，抗菌肽成为继青霉素等传统抗生素之后的新的抗菌制剂指日可待[12]。另外，抗菌肽在农业领域和作物品种改良方面也有着巨大的应用价值。因此，高活性的抗菌肽的开发和应用拥有广阔的空间。

猪小肠抗菌肽在动物体内广泛存在于嗜中性白细胞、粘膜和皮肤等部位，马卫明等[13]研究表明可以从猪小肠的组织中提取得到猪小肠抗菌肽，而动物肠道中有大量的细菌，肠道菌群平衡可以通过肠道内膜分泌的内源性抗菌肽来进行维持。有实验研究表明，肠道防御素的表达量可以调控肠道致病菌的易感性，活性降低，易感性增加。但是猪小肠抗菌肽通过小肠组织提取得到的量比较低，无法进行大规模的应用。本研究采用基因重组的方法成功的得到具有生物活性的抗菌肽，经体外抗菌实验表明，猪小肠抗菌肽具有较强的抑制猪常见致病菌的效果，表明猪小肠抗菌肽具有一定的维持肠道菌群平衡的能力。

当前在抗生素大量使用导致细菌产生广泛的耐药性，细菌耐药与控制耐药，已成为一个全球性的问题[14]。动物被耐药菌感染后会因抗菌药物治疗无效而增加其死亡率，近年研究发现抗菌肽具有抗菌谱广、稳定性高、而且因其独特的杀菌机制使其不易产生耐药性、又能抑杀耐药菌株，从而为将抗菌肽发展成为新一代的抗菌药物提供了研究基础[15]。本研究结果显示抗菌肽对常见的猪呼吸道菌具有较强的杀菌作用，如猪小肠抗菌肽对化脓性链球菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度均为49.8 μg/mL，较低浓度的抗菌肽就可以杀灭细菌。因此，抗菌肽成为新的抗菌制剂得到广泛的应用指日可待。

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·研究论文·

RESEARCH ON ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF CECROPIN P1 TO PORCINE RESPIRATORY BACTERIA

LI Lun-feng1,2, WEI Jian-chao2, XIE Chun-yang1, PENG Shuai1, LI Bei-bei2, LIU Ke2, SHAO Dong-hua2, QIU Ya-feng2, SHI Zi-xue3, MA Zhi-yong2

(1. College of Food Science and Technology, Jilin Agricultural University,Changchun 130000, China; 2.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 3. Shanghai Jiading District Municipal Agriculture Commission, Shanghai 201800, China)

Key words:Cecropin P1; antibacterial activity; minimum inhibitory concentration

Abstract:Antibacterial peptide cecropin P1 was originally isolated from the small intestines of the pigs. In the present study, the recombinant cecropin P1 produced in pichia pastoris was tested for its antibacterial activity against seven species of common swine respiratory bacteria including Streptococcus suis, Staphylococcus aureus, Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae, swine Bordetella bronchiseptica, swine enteropathogenic E.coli and Streptococcus pyogenes. The recombinant cecropin P1 showed different degrees of bacteriostasis for these seven respiratory bacteria as measured by MIC (minimal inhibitory concentration). The most signifi cant bacteristasis was observed for Streptococcus pyogenes, Pasteurella multocida and Staphylococcus aureus with MIC of 49.5 ug/mL, andmoderate antibacterial activity for Sreptococcus suis and E.coli. In contrast, the recombinant cecropin P1 had the least bacteriostasis for swine Bordetella bronchiseptica as the MIC was 398 ug/mL. Currently, the vigorous use of antibiotics has caused the bacteria to have developed the high-level resistance. The availability of the recombinant cecropin P1 is of great signifi cance as it possesses wide antimicrobial spectrum, toxin-free nature, high stability, less resistance and no residue in the body.

中图分类号：S852.616

文献标志码：A

文章编号：1674-6422（2016）01-0052-05

收稿日期：2015-11-09

基金项目：国家重点基础研究发展计划(2014CB542703);上海市科技兴农重点攻关项目（沪农科攻字（2013）第5-6号）

作者简介：李伦锋，女，硕士研究生，农产品加工及贮藏工程专业

通信作者：马志永，E-mail：zhiyongma@shvri.ac.cn；谢春阳，E-mail：xiechunyang@163.com