猪水肿病新型亚单位菌苗对小鼠的效力研究

胡利群，刘俞君，郭利伟，杨小林，刘国平

（1. 长江大学动物科学学院，荆州 434025；2. 中国动物疫病预防控制中心，北京 100125）



猪水肿病新型亚单位菌苗对小鼠的效力研究

胡利群1，刘俞君2，郭利伟1，杨小林1，刘国平1

（1. 长江大学动物科学学院，荆州 434025；2. 中国动物疫病预防控制中心，北京 100125）

摘 要：利用大肠杆菌表达猪水肿病大肠杆菌的水肿毒素SLT-IIeB，提取表达产物包涵体，再加入自行分离的我国流行的猪水肿病大肠杆菌Ee株（O139），和油乳佐剂乳化后制成亚单位菌苗，免疫昆明鼠，间隔2 w加强免疫1 次。每次免疫后采血检测毒素的ELISA 抗体和Ee株的凝集效价，第2次免疫2 w后用5LD50的猪水肿病大肠杆菌Ee株进行攻毒。结果显示，亚单位菌苗组与灭活菌苗组ELISA抗体水平有显著性差异，两种疫苗对Ee的保护力分别为90%和70%。本研究表明新型亚单位菌苗模式对同型菌株具有较好的保护力，为进一步研制高效的亚单位菌苗打下基础。

关键词：分泌毒素表达蛋白；亚单位菌苗；小鼠；保护力

猪水肿病由特定血清型的产类志贺氏毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，SLTEC）引起，多发生于断奶后仔猪，现已成为危害规模化养殖业的重要疾病之一[1-4]。SLT-IIe是致仔猪水肿病的产类志贺毒素大肠杆菌（SLTEC）的主要毒力因子。致猪水肿病大肠杆菌SLTEC以其菌毛F18ab（F107）黏附于小肠上皮细胞，定居和繁殖的细菌在肠内产生SLT-IIe并被吸收，SLT-IIe通过B亚基与肠上皮细胞的Gb4受体发生特异性结合，介导A亚基进入细胞核糖体，A亚基具有N-糖苷酶活性，特异性地切断28S rRNA 5'端4324位腺嘌呤的N-糖苷键，腺嘌呤残基因此脱落，使延伸因子EF-1的氨基酰化tRNA不能与60S核糖体亚基结合，从而阻断了细胞内蛋白质的合成，造成代谢功能紊乱，导致细胞死亡[5-7]。

预防和治疗水肿病的一般原则是尽量降低肠道内病原性大肠杆菌的数量，然而由于抗生素的滥用，导致了耐药菌株的出现，因而预防该病的最好方法为免疫接种。随着人们对仔猪水肿病致病机理的深入了解，有学者提出预防水肿病的发生，理想的疫苗不仅应保护仔猪抵抗大肠杆菌的附着，同时也应保护仔猪免受其产生的SLT-IIe的攻击。而目前国内用于预防该病的主要是灭活菌苗，其主要考虑的是O抗原，免疫效果并不稳定。国外学者用纯化的SLT-IIe类毒素主动免疫和SLT-IIe高免血清被动免疫后攻毒，取得了令人满意的免疫效果[8,9]。这说明研制以SLT-IIeB为免疫原来预防该病是可行的，而利用大肠杆菌的培养物上清液来提取毒素的传统方法成本较高，而且由于水肿毒素B亚单位分子量小，分离与纯化比较困难，不适合大规模生产的需要。因此，我们以3拷贝的基因工程重组蛋白SLTIIeB代替天然毒素，同时考虑菌体及毒素的保护力，将基因工程重组蛋白与灭活菌体混合制备亚单位菌苗，探询亚单位菌苗对小鼠的保护力，为猪水肿病大肠杆菌新型疫苗的研制奠定基础。

1　材料与方法

1.1质粒及菌种 猪水肿病大肠杆菌Ee株，由本实验室分离鉴定并保存[10]；pGEX-KG表达载体和BL21 （DE3）宿主菌为本试验室保存，表达3拷贝SLTIIeB的BL21（DE3）菌株由本实验室构建[11]。

1.2主要试剂 弗氏不完全佐剂、SKL（N-lanrayl sarcosine NaSalt， 十二烷基肌胺酸钠)）购自Sigma公司；IPTG 购自Promega 产品；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 购自SouthernBiotech 公司；溶菌酶以及氧化型、还原型谷胱甘肽购于北京原平皓生物技术有限公司。

1.3试验动物 6 w雌性SPF昆明系小鼠，购自湖北省医学科学院，共56只，随机分成4组，每组14只。其中每组4只用于抗体水平检测，其余10只用于攻毒试验。

1.4细菌培养及计数 大肠杆菌Ee种子菌划线接种于麦康凯培养基，37℃培养24 h，选取典型菌落接种TSB液体培养基，37 ℃培养至对数生长期时（OD600= 0.6～1.0）。每1000mL培养液接种100μL种子菌液，培养24 h后测定菌液OD值，计算菌体总数。

1.53拷贝SLT-IIeB基因的表达与纯化 取甘油保存的含有目的质粒的BL21菌株，接种细菌瓶小量培养过夜，d 2按1:100的比例接种大瓶，37℃培养至对数生长期时（OD600= 0.6～1. 0），加入IPTG 至终浓度为1 mmol/ L，进行3 h的诱导表达。诱导菌体用高频超声波处理数次，离心后将沉淀的包涵体溶解于含0.6 %SKL 的TE中，室温静置0.5～2h 后离心，取上清进行透析复性。取样进行SDS-PAGE 电泳，考马斯亮兰（R250）染色鉴定包涵体的纯度。蛋白质浓度用紫外分光光度计测定。

1.6疫苗的制备及免疫 疫苗种子菌Ee株的培养按实验室常规方法进行，培养后离心，加入甲醛磷酸盐缓冲液进行灭活。之后把灭活好的Ee株菌体和表达蛋白按一定的比例混合，进行乳化制苗，称为亚单位菌苗（其中每毫升含Ee株10亿，含水肿毒素表达蛋白约100μg）。同时制备单价Ee株菌灭活苗，菌体浓度与亚单位菌苗相同。将制备的亚单位菌苗与单价苗分点进行皮下注射免疫小鼠，间隔2 w后加强免疫1 次。对照组用PBS 缓冲液乳化后同样进行接种。一免后隔周采集血清，每次采集血清后，将同一组血清等量混合，采用间接ELISA及菌体凝集试验分别检测各组的毒素平均抗体水平及菌体平均凝集效价。

1.7抗体的检测 毒素的抗体按文献[11]自行建立ELISA方法进行检测。Ee株菌体抗体的检测按微量凝集试验进行[12]。

1.8小鼠感染试验 参照文献[10]测定Ee株的LD50，以1.3×109CFU（5LD50）剂量的大肠杆菌Ee株对小鼠进行腹腔攻毒。攻毒后15 d内定期观察实验鼠的临床表现并记录。

2　结果

2.1毒素包涵体的提取 取表达产物的包涵体，进行变性和复性，取少量进行SDS-PAGE 电泳以检测其纯度。结果如图1，箭头所指的分别为表达3拷贝SLT-IIeB融合蛋白，大小约为56 kDa 。

图1　表达毒素包涵体的SDS-PAGE结果Fig. 1 The SDS-PAGE results of the expressedSLT-IIeB inclusion body1、2: 包涵体; 3: 蛋白分子标记1,2 : SLT-IIeB inclusion body; 3: Protein Marker (蛋白质标记)

2.2两次免疫后的抗体水平变化 首免2 w后对小鼠进行断尾采血，检测SLT-IIeB的ELISA 抗体及菌体凝集价。亚单位菌苗组平均抗体水平阳性，灭活菌苗组平均抗体水平为阴性，菌体抗体凝集价两组均为1:4。第2 次免疫2 w后检测结果显示，亚单位菌苗组ELISA平均抗体水平达到最高，灭活菌苗组ELISA平均抗体水平为阳性并呈下降趋势，菌体抗体凝集价均为1:32。首免和二免的具体情况见图2、3。可以看到，二免后亚单位菌苗及灭活菌苗免疫组的ELISA平均抗体水平及凝集价在二疫后升高，并处于一个较高的水平，灭活疫苗组的ELISA抗体水平全部阳转，但抗体水平较低（图2）。菌体凝集价亚单位菌苗组的菌体凝集价的峰值较灭活菌苗组要高（图3）。

2.3攻毒的结果 二免2 w后试验组和对照组分别用5LD50Ee株进行攻毒。对照组的小鼠于12 h内全部死亡，小鼠腹腔注射4～12h后发病，眼睑、面部水肿，伴随着共济失调、麻痹或惊厥等神经症状。剖检发现肺有出血点，肝脾肿大，肠系膜和胃壁浆液性水肿，肠明显水肿，且有出血现象。心、肝、脾、心血、脑脊液等分离到感染菌。试验组中亚单位菌苗组在攻毒后1只小鼠6 h后死亡，其余小鼠攻毒后24 h 精神沉郁，不食，扎堆，之后逐步恢复正常，d 3时和攻毒前无异，保护率为90%（9/10）。灭活菌苗组于攻毒后6～12 h 内死亡3 只，其他小鼠攻毒后24 h 精神沉郁，不食，扎堆，之后逐步恢复正常，观察到d 3和攻毒前无异，保护率为70% （7/10）。

图2　免疫后SLT-IIeB ELISA抗体水平检测Fig. 2 ELISA IgG titres against SLT-IIeB after fi rst immunization (mean OD630)

图3　免疫后菌体凝集价检测Fig. 3 Agglutination titers after fi rst immunization

表1 免疫后小鼠攻毒保护率结果Table 1 Immunization protection rate

3　讨论

猪水肿病在世界各地都有发生，我国也常见报道，是多年来困扰我国养猪业的问题之一。本病呈地方性流行，或零星散发。在发病的猪群中，发病率为30～40%，死亡率可达80%～100%。该病主要发生在断乳后1～2 w的仔猪，尤其在发育良好的仔猪群，造成很大的经济损失，是断奶仔猪危害较严重的疾病。猪群发病率不高，但死亡率很高，虽然除了疫苗接种外也有一些防控措施，但效果并不明显，因而研制高效的疫苗成为控制此病的首选。

猪水肿病大肠杆菌虽然血清型较为特定，但主要血清型也有十几种之多，这给该病的防制带来了难度，传统的灭活菌苗对于此病的防治显然不够。鉴于猪水肿病大肠杆菌的致病因子比较固定（SLTIIe及F18），而水肿毒素SLT-IIe是引起水肿症状的直接致病因子，其B亚单位（SLT-IIeB）无酶活性，是水肿毒素的保护性抗原，因此SLT-IIeB对各型间的交叉保护可能起着重要的作用。因此，同时考虑菌体及毒素的保护力的新型疫苗有可能是防治猪水肿病的高效疫苗。

致猪水肿病大肠杆菌鄂E株（Ee）是本实验室从武汉分离的地方菌株，动物致病性试验表明该菌对小鼠有较强的致病性，该菌肉汤培养物的无菌滤液能致死小鼠且剖检见相关脏器水肿，并可引起Vero细胞死亡。静脉注射断奶仔猪能复制典型水肿病症状[10]。因此我们选择Ee株为疫苗候选菌株。水肿毒素B亚单位分子量小，分离与纯化比较困难，不适合大规模生产的需要，利用基因工程的方法则可解决这一问题。经过前期的研究发现，3拷贝SLTIIeB的融合表达提高了表达蛋白的生物学活性与免疫原性[11]，因此，我们选择了3拷贝SLT-IIeB的融合表达产物为候选毒素。

抗体监测结果显示，水肿毒素B亚单位ELISA抗体水平亚单位菌苗组与普通灭活菌苗有显著提高，这说明添加的重组蛋白具有生物学活性，表现了良好的免疫原性。有趣的是亚单位菌苗组菌体凝集价与菌苗虽然趋势相同，但亚单位菌苗组菌体凝集价相对要高，具体机制并不清楚，据推测，可能是因为血管内皮细胞具有水肿毒素受体，重组SLT-IIeB促进了机体对疫苗的吸收与应答[13]，那么SLT-IIeB是否既是免疫原，同时也发挥类似佐剂的作用？这有待进一步的证实。

攻毒结果初步表明，亚单位菌苗组对Ee株的攻击具有较好的保护力（90%），表明我们表达的毒素有望取代天然毒素作为灭活菌苗的成份来提高普通灭活菌苗对于强毒株的保护。尽管如此，无论是灭活菌苗组还是亚单位疫苗菌苗组对于同型菌株的保护力均没有达到100%的保护力。这主要与我们的试验设计有关，本试验的目的主要是探讨亚单位菌苗的可行性，也就是添加的重组蛋白是否对疫苗的保护力有显著性提高，为重组蛋白能否替代天然毒素提供试验支持，因此我们在疫苗制作时选择了较低的菌体浓度。结果表明重组蛋白替代天然毒素作为疫苗添加成份及亚单位菌苗在实践上是可行的。

总的来说，亚单位菌苗兼具灭活疫苗及基因工程亚单位的优点，在实践上具有可操作性，这为进一步研制高效的新型猪水肿病大肠杆菌疫苗打下了基础。

参考文献

[1] Matise I. Swine edema disease [J]. Veterinarais Zurnals (Latvia), 1999.

[2] Fratamico P M, Bhagwat A A, Injaian L, et al. Characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli strains isolated from swine feces [J]. Foodborne pathogens and disease, 2008, 5(6): 827-838.

[3] Oanh T K N, Nguyen V K, Do T N, et al. Escherichia coli strains causing edema disease in northern Vietnam share an identical verotoxin 2e[J]. Tropical animal health and production, 2010, 42(8): 1797-1804.

[4] Imberechts H, De Greve H, Lintermans, P. The pathogenesis of oedema disease in pigs[J]. Vet Microbiol, 1992, 31, 221-233.

[5] Coddens A, Verdonck F, Tiels P, et al. The age-dependent expression of the F18+E.coli receptor on porcine gut epithelial cells is positively correlated with the presence of histo-blood group antigens[J]. Vet Microbiol, 2007, 122, 332-341.

[6] Verdonck F, Tiels P, van Gog, et al. Mucosal immunization of piglets with purified F18 fimbriae does not protect against F18+Escherichia coli infection[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2007, 120, 69-79.

[7] Oanh T K N, Nguyen V K, De Greve H, et al. Protection of piglets against Edema disease by maternal immunization with Stx2e toxoid[J]. Infection and Immunity, 2012, 80(1): 469-473.

[8] Oanh T K N, Nguyen V K, Do T N, et al. Escherichia coli strains causing edema disease in northern Vietnam sharean identical verotoxin 2e[J]. Tropical animal health and production, 2010, 42(8): 1797-1804.

[9] Moredo F A, Cappuccio J A, Insarralde L, et al. Genotypic characterization of toxigenic Escherichia coli isolated from pigs with postweaning diarrhea (PWD) and edema disease (ED)[J]. Revista Argentina de microbiologia, 2011, 44(2): 85-88.

[10] 刘国平, 吴斌, 刘梦元, 等. 致猪水肿病大肠杆菌的分离鉴定及生物学特性[J]. 中国兽医学报, 2005, 25(1): 31-33.

[11] 林艺远. 致猪水肿病大肠杆菌ELISA抗体检测方法及基因工程亚单位疫苗的初步研究[J]. 武汉: 华中农业大, 2006.

[12] 吴文福, 巫月生, 李嘉爱, 等. 应用微量凝集试验检测鸡抗猪大肠杆菌抗体方法的探索[J]. 广东畜牧兽医科技, 2002, 27(1): 33-35.

[13] 周宏超, 高立云, 王中杰, 等. 猪水肿病病理模型复制[J].西北农业学报, 2008, 17(2): 16-19.

·研究论文·

PROTECTION OF A GENETIC SUBUNIT BACTERIN AGAINST PORCINE EDEMA DISEASE IN MOUSE MODEL

HU Li-qun1, LIU Yu-jun2, GUO Li-wei1, YANG Xiao-lin1, LIU Guo-ping1

(1. College of Animal Science, Yangtze University, Jingzhou 434025, China; 2. China Animal Disease Control Center, Beijing 100125, China)

Key words:Porcine edema disease; exotoxin SLT-IIeB; subunit bacterin; protection

Abstract:The exotoxin SLT-IIeB of Escherichia coli Ee strain was expressed in E.coli and purifi ed. The recombinant protein was mixed with inactivated Ee strain and then emulsifi ed with oil adjuvant to prepare a mixed subunit bacterin. Mice were immunized twice at week 0 and 2 and challenged intraperitoneally with virulent Ee strain at week 4. Antibodies were detected in ELISA and agglutination test. After the second immunization, antibody level increased obviously and the immune protection against virulent Ee strain was 70% and 91.7% in subunit bacterin group and whole bacterin group, respectively. In conclusion, the mixed subunit bacterin induced good protection against virulent Ee strain, which was promising for development of a highly effi cacious vaccine against porcine edema disease.

中图分类号：S852.61

文献标志码：A

文章编号：1674-6422（2015）06-0057-05

收稿日期：2015-11-02

基金项目：国家863计划（2006AA10A206）；湖北省教育厅中青年重点项目（No. D20121205）

作者简介：胡利群，女，博士生，预防兽医学专业

通信作者：刘国平，E-mail：hhaaiieerr@163.com