柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4酵母双杂交诱饵质粒的构建与检测

王自文，董 辉，赵其平，夏伟丽,2，朱顺海，门启婓,2，李 聪，朱雪龙，韩红玉，黄 兵,3

（1. 中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海200241；2. 上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234；3. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009）



柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4酵母双杂交诱饵质粒的构建与检测

王自文1，董 辉1，赵其平1，夏伟丽1,2，朱顺海1，门启婓1,2，李 聪1，朱雪龙1，韩红玉1，黄 兵1,3

（1. 中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海200241；2. 上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234；3. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009）

摘 要：为了筛选出柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶（EtCDPK4）在虫体内发挥作用时的作用受体即相互作用蛋白，构建了能够应用于筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的诱饵重组质粒pGBKT7-EtCDPK4，本研究以柔嫩艾美耳球虫子孢子为材料，提取了总RNA，经反转录得到cDNA第一链，利用PCR的方法扩增获得了该基因大小为1660 bp的EtCDPK4的功能区片段，并将其连接于酵母BD诱饵pGBKT7载体上，经双酶切鉴定和序列分析，以及检测了pGBKT7-EtCDPK4在酵母双杂交系统中的自激活、细胞毒性和表达情况。结果显示，成功构建了酵母双杂交诱饵重组质粒pGBKT7-EtCDPK4，在酵母双杂交系统中没有自激活活性和细胞毒性，且在酵母细胞Y2HGold中能够进行表达。表明所构建的诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4可以应用于酵母双杂交系统中，用于筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库，获得可能与EtCDPK4具有相互作用的蛋白质。

关键词：柔嫩艾美耳球虫；钙依赖蛋白激酶；诱饵质粒；自激活作用；细胞毒性

钙依赖蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases，CDPK）是一种钙依赖而钙调素不依赖的蛋白激酶或类似钙调素结构域的蛋白激酶（Calmodulin-like domain protein kinases），是由多基因编码的大家族，同时CDPK也是一种非常重要的Ca2+信号蛋白。钙依赖蛋白激酶家族（CDPKs）的成员均为单肽链且具有非常明显的结构特征，从N端到C端共有4个功能结构区，依次是可变区、催化区、连接区和调控区[1]。CDPK仅存在于植物[2]、绿藻[3]、纤毛虫以及一些顶复门原虫中[4]，但在细菌、真菌、酵母、线虫和脊椎动物中尚未发现[5]。大部分的顶复门原虫都是严格细胞内寄生的病原，只有进入宿主细胞内才能进行生长和繁殖，它们可通过本身的机制来逃避宿主的免疫屏障以及药物对它们的杀伤作用。这些顶复门原虫能够入侵宿主细胞具有很多的机制，然而CDPKs介导的信号传导系统是一种重要机制，研究发现CDPKs激发的生理效应是推动顶复门原虫成功入侵和逃逸宿主细胞以及虫体自身发育成熟的关键因素之一[6]。尽管目前对于CDPKs在柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）体内发挥作用的具体详细机制还不清楚，但已有的研究发现一些CDPKs在E. tenella入侵宿主细胞过程中发挥重要作用[6]，因此通过阻断CDPK在E. tenella体内的信号传导很可能就会阻断虫体对宿主细胞的入侵，从而减弱E. tenella这类病原所带来的危害。阻断CDPK诱发的信号传导过程可以有2种方式：通过使用特异性的抑制剂来抑制CDPK本身或者阻断CDPK下游的作用底物，使CDPK不能够发挥作用[7]。为了弄清楚EtCDPK4在E. tenella中的基本作用方式，及其下游的效应分子，本文构建了E. tenella CDPK4的酵母双杂交系统诱饵质粒，旨在为今后通过酵母双杂交技术筛选EtCDPK4的下游作用底物提供基础。

1　材料和方法

1.1虫株及所需试剂 E. tenella孢子化卵囊上海株（资源编号：CAAS21111601，中国农业科学院上海兽医研究所原虫病创新团队保存）；M-MLV Reverse Transcriptase Kit（Invitrogen，USA）；Trizol试剂和RNase-free water、限制性内切酶EcoRΙ和SalΙ（TaKaRa）；Regular Agarose G10（Gene Company）；大肠杆菌TOP10感受态细胞，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，DNA Marker DL2000，酵母质粒提取试剂盒和质粒小提试剂盒（TIANGEN）；T4 DNA Ligase和T4 DNA Ligase Buffer（Promega，USA）；pGBKT7质粒（本实验室保存）；酵母菌株Y2HGold，X-α-Gal，YPD和YPDA酵母培养基，酵母质粒转化试剂盒和SD/-Trp缺陷性培养基（Clontech）；Adenine（Sigma）；Kana抗生素（Sangon Biotech）。

1.2引物的设计 对EtCDPK4进行限制性酶切位点分析后根据pGBKT7载体上的多克隆位点和EtCDPK4的编码区序列设计带有酶切位点的PCR引物。EtCDPK4-UP：5'-CCGGAATTCAGCAGGTGATGG GTGGGCGGGAGGT-3'（划线部分为EcoR I位点）

EtCDPK4-LOW：5'-GCGTCGACAATTCGTCCCAG TCAATCTGCCCATCGC-3'（划线部分为Sal I位点）

1.3目的基因EtCDPK4的PCR扩增 纯化E. tenella孢子化卵囊，提取子孢子，方法参见文献[8]。利用Trizol试剂提取子孢子总RNA，经1%凝胶电泳鉴定合格后用M-MLV Reverse Transcriptase Kit将其反转录为cDNA，利用合成的特异性引物和子孢子cDNA模板进行PCR扩增，产物经1%凝胶电泳分析。

1.4PCR产物克隆与鉴定 回收产物用EcoRΙ和SalΙ进行酶切后将其定向连接到同样进行酶切的pGBKT7载体中，再转化TOP10感受态细胞。经测序、酶切鉴定后，将正确插入目的基因片段的重组质粒命名为pGBKT7-EtCDPK4。

1.5酵母菌株Y2HGold感受态细胞制备 在YPDA培养基上对Y2HGold酵母菌划板，30℃培养4 d，挑取3个直径大约3～4mm的酵母菌于离心管中，30℃，250r/min震荡培养12 h，测定酵母菌OD600值来评价生长速度，取生长速度最快的进行实验。取酵母菌5 μL于YPD液体培养基中，30℃，250r/min震荡培养16～20h，直到OD600达到0.15～0.3，离心收获酵母菌沉淀, 重悬酵母细胞，30℃，250r/min震荡培养3～5 h，直到OD600达到0.4～0.5, 离心收获酵母细胞沉淀，用无菌ddH2O重悬细胞沉淀，离心再次收获细胞沉淀。再用TE/LiAc重悬酵母细胞，瞬时离心15 s，TE/LiAc Buffer重悬酵母细胞，将其置于冰上立即转化。

1.6诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4转入酵母Y2HGold感受态细胞 取鲱鱼精DNA(10 mg/mL)，煮沸5 min，立即将其置于冰上冷却，重复一次，置于冰上备用。在2个Eppendorf管中按顺序分别加入pGBKT7-EtCDPK4诱饵质粒或者pGBKT7空质粒，鲱鱼精DNA和酵母感受态细胞，加入PEG/LiAc温和混匀后30℃孵育30 min，结束后加入DMSO，混匀之后，42℃温育15 min。重悬酵母细胞沉淀，30℃，250r/min震荡培养90 min后，离心尽量弃去上清，用0.9%（w/v）NaCl溶液重悬转化子细胞沉淀，做10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释后涂布于SD/-Trp营养缺陷性固体培养基上，每块板涂布100μL稀释产物，30℃培养4～5d，直到平板上生长出乳白色酵母菌落。

1.7重组酵母菌PCR鉴定 提取重组酵母菌质粒进行PCR鉴定，鉴定时采用pGBKT7的通用引物即T7和3'BD。

1.8pGBKT7-EtCDPK4对Y2HGold报告基因自激活活性的检测 根据Y2HGold酵母菌的表型选择检测Mel1+和ADE2+这2个报告基因。将转化且PCR鉴定为阳性的酵母单菌落挑于0.9%（w/v）NaCl溶液重悬后，涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/-Ade三种营养缺陷性固体培养基上，每块板涂布100μL酵母菌液，30℃培养4～5d，直到长出酵母单菌落。

1.9pGBKT7-EtCDPK4对Y2HGold细胞毒性的检测 诱饵pGBKT7-EtCDPK4对Y2HGold细胞毒性检测分2个阶段，即酵母形态表观检测和生长速度动态观测。将转化且PCR鉴定为阳性的诱饵pGBKT7-EtCDPK4和已经转化pGBKT7的酵母单菌落挑取于0.9%（w/v）NaCl溶液重悬后，分别涂布于SD/-Trp营养缺陷性培养基上，每块板涂布100μL酵母菌液，30℃培养4～5 d，直到长出酵母单菌落。将诱饵pGBKT7-EtCDPK4酵母菌和pGBKT7酵母菌各挑取一个单菌落于SD/-Trp/Kan+(20 μg/mL)液体培养基的500 mL锥形瓶中，30℃，250 r/min震荡培养24 h，其中在0、16、18、20、22、24 h分别测定OD600值。

1.10pGBKT7-EtCDPK4在Y2HGold宿主菌中表达情况检测 2个SD/-Trp营养缺陷性液体培养基的离心管中各挑取一个转化有诱饵质粒和空质粒的单菌落，30℃，250r/min培养12 h，将其倾入含YPD液体培养基的锥形瓶中，继续30℃，250r/min培养3～5h。直到OD600达到0.4～0.6时，迅速将酵母培养物倒入提前预冷的离心管中，离心弃上清，用灭菌水重悬细胞沉淀，离心后重新得到细胞团块，然后用TCA buffer重悬，将离心管放置在冰上，转移细胞上清到一个新的离心管中，震荡破碎酵母细胞壁，转移上清到新的离心管中，并且将离心管置于冰上1 min，离心，弃去上清留下细胞沉淀，使用TCALaemmli Loading buffer重悬后置于沸水中20 min，各取5 μL提取的酵母蛋白进行Western blot检测。

2　结果

2.1EtCDPK4基因的PCR扩增 PCR产物在1%的凝胶电泳中发现在2 000bp以下有一个特别明显的条带，与预期片段基本相符（图1A）。经序列测定分析，确定为EtCDPK4基因片段。

2.2重组诱饵质粒构建及鉴定 目的条带用EcoRΙ 和SalΙ进行切割(图1B)回收后，与同样酶切的pGBKT7进行连接转化TOP10感受态细胞，提质粒进行双酶切鉴定（图1C），将酶切鉴定正确的质粒进行测序，测序结果表明，与原序列一致，说明诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4构建成功。

2.3诱饵pGBKT7-EtCDPK4转入Y2HGold的鉴定诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4转入Y2HGold中，待乳白色的单菌落长出后挑12个单酵母菌落于YPD液体培养基中，30℃，250r/min震荡培养12 h后提取质粒，用通用引物T7和3'BD验证，结果表明挑取的12个酵母单克隆均为阳性（图2）

图1　EtCDPK4扩增产物的电泳鉴定(A)，目的条带和质粒的双酶切反应(B)和重组酵母诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4的双酶切鉴定(C)Fig. 1 PCR products of EtCDPK4 (A), the double restrictionenzyme digestion for target gene and pGBKT7(B) and recombinant yeast bait plasmid identifi cation of pGBKT7-EtCDPK4 by double restriction endonuclease digestion(C)M: DNA分子量标准; 1: EtCDPK4: PCR产物; 2: EtCDPK4双酶切产物; 3: 酵母诱饵质粒双酶切产物; 4: pGBKT7-EtCDPK4M: DNA Marker (DL2000) 1: PCR products of EtCDPK4; 2: The double restrictionenzyme digestion of EtCDPK; 3: pGBKT7 4: pGBKT7-EtCDPK4

图2　酵母诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4转化入Y2HGold酵母菌中抽提重组质粒的PCR鉴定Fig. 2 PCR identifi cation of extracted recombinant yeast bait plasmid pGBKT7-EtCDPK4 in the Y2HGold yeast strainM: DNA分子质量标准; 1～12: 样品序号M: DNA Marker (DL2000); 1-12: Sample

2.4诱饵pGBKT7-EtCDPK4对Y2HGold报告基因自激活检测 诱饵pGBKT7-EtCDPK4对Y2HGold报告基因自激活检测，结果显示在SD/-Trp和SD/-Trp/ X-α-Gal营养缺陷性固体培养基上长出圆润且为乳白色的酵母单菌落（图3A），说明构建的pGBKT7-EtCDPK4诱饵重组质粒对Y2HGold酵母宿主菌的Mel1+报告基因无自激活活性（图3B）；而在SD/-Trp/-Ade营养缺陷性固体培养基上没有酵母菌落生长，这说明所构建的pGBKT7-EtCDPK4诱饵重组质粒对Y2HGold酵母宿主菌的ADE2+报告基因无自激活活性（图3C）。

图3　pGBKT7-EtCDPK4对Y2HGold酵母菌报告基因自激活活性的检测Fig. 3 Detection of self-activity reporter gene of pGBKT7-EtCDPK in Y2HGold yeast strainA: SD/-Trp营养缺陷性固体培养基; B: SD/-Trp/X-α-Gal营养缺陷性固体培养基; C: SD/-Trp/-Ade营养缺陷性固体培养基A: SD/-TrpNutrient defi cient solid medium; B: SD/-Trp/X-αgal nutrient defi cient solid medium; C: SD/-Trp/-Ade nutrient defi cient solid medium

2.5诱饵pGBKT7-EtCDPK4对Y2HGold细胞毒性检测 诱饵pGBKT7-EtCDPK4对Y2HGold酵母菌细胞毒性检测，表明在SD/-Trp营养缺陷性固体培养基上，诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4（图4A）的酵母菌大小和形态与pGBKT7（图4B）的酵母菌相近。同时在SD/-Trp/Kan+(20 μg/mL)液体培养基中震荡培养20 h时，其OD600值为0.8380，其中在0、16、18、20、22、24h测定的OD600值见表1，这些时间点酵母生长均呈现上升趋势（图5），与空载体转化酵母后的生长趋势差异不明显，说明pGBKT7-EtCDPK4诱饵质粒对Y2HGold酵母宿主菌没有细胞毒性。

2.6诱饵pGBKT7-EtCDPK4在Y2HGold中表达情况的检测 Western blot 检测pGBKT7-EtCDPK4 在Y2HGold中的表达。与对照比较，在蛋白分子量标准55～70kDa间有大小符合EtCDPK4（约62.6kDa）的条带，表明诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK 4在Y2HGold酵母菌中表达（图6）。说明构建的pGBKT7-EtCDPK4诱饵质粒可用于酵母双杂交系统。

3　讨论

图4　pGBKT7-EtCDPK4对Y2HGold宿主酵母菌细胞毒性的检测Fig. 4 Detection of pGBKT7-EtCDPK4 on the cytotoxicity of Y2HGold host yeast cellsA: pGBKT7空质粒; B: pGBKT7-EtCDPK4诱饵重组质粒A: pGBKT7 plasmid; B: pGBKT7-EtCDPK4 bait recombinant plasmid

图5　pGBKT7-Y2HGold和pGBKT7-EtCDPK4-Y2HGold酵母菌的生长趋势Fig. 5 Growth rate of pGBKT7-Y2HGold and pGBKT7-EtCDPK4-Y2HGold

表1 不同时间点pGBKT7-Y2HGold和pGBKT7-EtCDPK4-Y2HGold的OD600值Table 1 At different time points OD600value of pGBKT7-Y2HGold and pGBKT7-EtCDPK4-Y2HGold

图6　Western blot 鉴定pGBKT7-EtCDPK4在Y2HGold宿主酵母菌中表达Fig. 6 Western blot detection of pGBKT7-EtCDPK4 expression in Y2HGoldM: 蛋白分子量标准; 1、2: pGBKT7-Y2HGold酵母蛋白; 3、4: pGBKT7-EtCDPK4-Y2HGold酵母蛋白M: PageRulerTMprestained Protein Ladder; 1, 2: Control of pGBKT7-Y2HGold yeast protein; 3, 4: pGBKT7-EtCDPK4-Y2HGold yeast protein

目前，对于E. tenella钙依赖蛋白激酶家族（CDPKs）的成员已经被揭示了3个，分别是EtCDPK1、EtCDPK2[9]和EtCDPK3[10]，它们都是E.tenella入侵宿主细胞的相关分子，但是它们在E.tenella体内发挥作用的具体详细作用机制目前尚不清楚，而EtCDPK4是本实验室之前通过RACE技术得到的E.tenella的一个新基因，通过对其生物信息学分析，发现它具有钙依赖蛋白激酶家族（CDPKs）成员的基本特征，因此，命名为EtCDPK4。CDPKs在顶复门原虫作为接收Ca2+信号的主要效应分子，将信号传递给下游分子，从而发挥功能，这一过程在顶复门原虫完成整个生活史的过程中发挥着极其重要的作用。研究发现CDPKs能够影响顶复门原虫一系列的生理生化活动，促进顶复门原虫致密斑、微线体、棒状体蛋白的分泌，使虫体的运动性加强，入侵宿主细胞的能力增强，从而更加适应宿主细胞的微环境[11]。对刚地弓形虫（Toxoplasma gondii，Tg）的CDPKs研究发现，TgCDPKs可以促进虫体顶部微线体蛋白质的分泌，而这些分泌的蛋白在T.gondii入侵宿主细胞时是必需的[12,13]。同样，在对恶性疟原虫（Plasmodium falciparum，Pf）的研究发现CDPKs在P. falciparum的生活史过程中也具有重要作用，通过序列比对发现PfCDPKs家族有7个成员，其中PfCDPK1具有促进P. falciparum的运动性和入侵细胞的作用，并且PfCDPK1对于P. falciparum在宿主血液中的发育和成熟也极其重要。Ca2+对P. falciparum的配子发育过程有直接的影响，而PfCDPK3和PfCDPK4是Ca2+影响P. falciparum配子发育过程的中介，因此，这两个蛋白在配子发育过程中发挥重要作用。同样研究发现PfCDPK5参与了P. falciparum从宿主红细胞中逸出的过程[14]。在E. tenella中，研究发现EtCDPK3与子孢子入侵宿主细胞和在宿主细胞内的生长繁殖有关[10]。因此，推测EtCDPK4很可能在E.tenella的生活史中也发挥着重要作用。

EtCDPK4接收的Ca2+信号需要传递给下游作用分子，而这些作用分子都是EtCDPK4直接或者间接的作用底物。对于CDPKs家族成员的作用底物在植物上研究的较为透彻和清楚，迄今发现的CDPKs底物包括代谢酶类（如蔗糖合成酶、PEP梭化酶、亚硝酸还原酶等）、胁迫相关蛋白（如PAL）、抗菌蛋白（如马铃薯梭肤酶抑制剂、磷脂转移蛋白、植保素等）、离子通道蛋白（如ACAZ、KATl、H+-ATpase等）、其他蛋白（如热稳定蛋白）等[15]。为了获得EtCDPK4下游作用底物，本研究选择使用高效传统的酵母双杂交技术来进行筛选。酵母双杂交系统是由Fields等[16]在研究真核基因转录调控中建立的，该技术是发现和研究蛋白质相互作用的新技术，近几年得到了广泛的运用，可用来研究活细胞内蛋白质的相互作用，还能用来发现新的蛋白质的作用，是一种具有很高灵敏度的研究技术[17]。酵母双杂交系统的最为重要的用途就是从cDNA文库中寻找与已知蛋白质相互作用的未知蛋白质，检测目的基因的转录情况，寻找与已知蛋白质能相互作用的未知蛋白质[18]。目前，酵母双杂交技术在研究肿瘤诱发信号通路相关分子、病毒入侵宿主细胞所需受体、植物细胞内信号转导以及寄生虫与宿主相互作用方面均取得了突破性的进展[19-21]，但是在以E. tenella作为病原的研究上应用仍然较少。酵母双杂交系统能够被很好应用的前提是要构建符合酵母双杂交系统筛选特性的诱饵质粒。诱饵质粒的构建可以采用传统的分子克隆的方法，本研究在酵母双杂交GAL4系统的基础上成功地构建了GAL4-BD结构域的诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4，并将诱饵质粒成功的转化入经过人工改造的Y2HGold酵母宿主菌株中，通过Trp营养缺陷性培养基进行筛选，重组转化子能够在SD/-Trp营养缺陷性固体培养基上生长出乳白色且圆润的酵母单菌落，这表明带有Trp营养缺陷性筛选标记的诱饵质粒已成功的转入到Y2HGold宿主酵母菌株中。

构建好的诱饵质粒需要进行3种特性的检测，分别是诱饵质粒的自激活活性、细胞毒性和酵母宿主中的表达特性，这三种特性必须同时满足才可以将诱饵质粒应用于下一步的酵母双杂交筛选试验中[22-25]，其中，对于自激活活性的检测是通过选择宿主酵母菌的一些报告基因，然后通过使用一些酵母专属的营养缺陷性培养基进行培养，看其是否能够单独的激活这个报告基因，通常检测α-半乳糖苷酶的活性，如果所构建的酵母诱饵质粒具有自激活活性，那么需要对目的基因进行结构域的剪切后才可以应用于酵母双杂交系统[26-28]。本研究在诱饵质粒自激活活性检测时，选择检测Y2HGold酵母宿主菌株的MEL1+和ADE2+这两个报告基因，通过使用SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/-Ade二重营养缺陷性固体培养基来检测诱饵质粒的自激活活性，结果表明pGBKT7-EtCDPK4对宿主菌株的报告基因MEL1+、ADE2+没有自激活作用，因此所构建的诱饵质粒不能够单独的去激活GAL4结构域UAS下游的启动子。对于细胞毒性的检测主要是评价其生长速度，如果诱饵质粒和转入空质粒的酵母菌生长速度相近或者高于空质粒则判定其对酵母宿主菌没有毒性，如果诱饵质粒具有毒性，则构建的诱饵质粒不能应用于酵母双杂交系统[27,28]。在检测构建的pGBKT7-EtCDPK4诱饵质粒产生的蛋白质对酵母宿主菌是否有细胞毒性的试验中，将转化了pGBKT7-EtCDPK4诱饵质粒的酵母菌Y2HGold在SD/-Trp固体培养基上生长的形态大小与转化了pGBKT7空质粒的酵母宿主菌形态大小基本相近，且与空质粒在SD/-Trp/Kan（20μg/mL）液体培养基中增殖的速度均为不断增加呈现出极速上升的趋势，在20 h时均能够超过0.8，说明本研究构建的pGBKT7-EtCDPK4诱饵质粒产生的蛋白对酵母菌Y2HGold无细胞毒性作用，诱饵质粒可以在酵母宿主菌中稳定的存在。对于诱饵质粒在酵母宿主菌中的是否表达主要是通过Western blot检测其是否在酵母体中能够表达诱饵蛋白，如果不表达则无法将其应用于酵母双杂交系统中[29-31]。使用实验室已有的Anti-rEtCDPK4的兔血清对pGBKT7-EtCDPK4诱饵质粒在Y2HGold酵母菌株中的蛋白表达进行Western blot鉴定，结果获得了与预期EtCDPK4蛋白分子量大小相近的特异条带，这表明pGBKT7-EtCDPK4诱饵质粒在Y2HGold酵母菌中能够稳定表达诱饵蛋白。

因此，本研究构建的pGBKT7-EtCDPK4诱饵质粒产生的蛋白对Y2HGold酵母菌的生长无细胞毒性，可以在酵母体中稳定的存在，也没有Y2HGold酵母菌株自带的报告基因的自激活作用，且在Y2HGold酵母菌株中能够表达诱饵蛋白。因此可以利用E.tenella的EtCDPK4基因编码的蛋白质作为一个诱饵，来筛选E. tenella子孢子酵母双杂交cDNA文库，获得在子孢子中与其相互作用的蛋白，为研究EtCDPK家族成员在钙离子介导的信号通路中作用和功能奠定一定的基础。

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·研究论文·

DETECTION AND CONSTRUCTION OF EIMERIA TENELLA CDPK4 BAIT

PLASMID FOR YEAST TWO-HYBRID SYSTEM

WANG Zi-wen1, DONG Hui1, ZHAO Qi-ping1, XIA Wei-li1,2, ZHU Shun-hai1, MEN Qi-fei1,2, LI Cong1, ZHU Xue-long1, HAN Hong-yu1, HUANG Bing1

(1. Key Laboratory of Animal Parasitolgy of Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China; 3. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

Key words:Eimeria tenella; CDPK; bait plasmid; self-activation; toxic effect

Abstract:In order to screen for the interacting protein with CDPK4 of Eimeria tenella, the recombinant bait plasmid pGBKT7-EtCDPK4 was constructed, which can be used to screen for Eimeria tenella yeast two-hybrid cDNA library. The total RNA of E. tenella sporozoite was extracted, then the fi rst strand of cDNA was obtained by reverse transcriptase. The 1660 bp fragment of EtCDPK4 was amplifi ed by PCR and cloned into yeast BD bait vector pGBKT7, then the recombinant plasmid pGBKT7-EtCDPK4 was identifi ed by double enzyme digestion and sequenced. The self-activation, toxic action and protein expression of the recombination bait plasmid pGBKT7-EtCDPK4 were tested, respectively. These results show that the recombinant pGBKT7-EtCDPK4 plasmid was constructed successfully and proved to be no self-activation and toxic action. Moreover, it was expressed in the Y2HGold yeast cell. So the recombinant plasmid pGBKT7-EtCDPK4 can be used to screen for Eimeria tenella sporozoites yeast two-hybrid cDNA library.

中图分类号：S852.723

文献标志码：A

文章编号：1674-6422（2016）01-0062-08

收稿日期：2015-12-18

基金项目：国家自然科学基金（31572266）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（2014JB03）

作者简介：王自文，男，硕士研究生，预防兽医学专业

通信作者：黄 兵，E-mail：hb@shvri.ac.cn；韩红玉，E-mail：hhysh@shvri.ac.cn