降解布洛芬克隆菌株转座子插入突变体的构建

卫亚红，段　敏，向照举，曲　东，王　瑶

(1 西北农林科技大学 a 生命科学学院，b 旱区作物逆境生物学国家重点实验室，c 旱区生物质能研究中心，d 资源环境学院，陕西 杨凌 712100；2 陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安 710062)



降解布洛芬克隆菌株转座子插入突变体的构建

卫亚红1a,1b,1c，段敏1a，向照举2，曲东1d，王瑶1a

(1 西北农林科技大学 a 生命科学学院，b 旱区作物逆境生物学国家重点实验室，c 旱区生物质能研究中心，d 资源环境学院，陕西 杨凌 712100；2 陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安 710062)

[摘要]【目的】 敲除布洛芬福斯质粒文库克隆菌株4F6中的邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因(C23O)，构建其Tn5插入突变体，为布洛芬降解调节因子的深入研究奠定基础。【方法】 以构建好的3G7 Tn5突变体菌株为基础，借助pKD46质粒的λ-red同源重组酶，将转座子Tn5从菌株3G7中电击转化至4F6，消除pKD46质粒，敲除4F6菌株中的C23O基因，测定出发菌株3G7、4F6及Tn5插入突变体菌株3G7-G9、3G7-H5、4F6-G9和4F6-H5间位苯环的裂解活性。【结果】 42 ℃条件下消除了Tn5插入突变体受体菌4F6中的pKD46质粒，构建了4F6-G9和4F6-H5突变体。Tn5转座子插入突变株3G7-G9、3G7-H5、4F6-G9和4F6-H5的间位苯环裂解活性无显著差异；菌株4F6的间位苯环裂解活性虽明显高于菌株3G7，但也仅有1个C23O基因，其活性差异可能与布洛芬降解调控因子有关。【结论】 提供了一种简便有效定位并敲除C23O基因的方法。

[关键词]可降解布洛芬福斯质粒；Tn5突变体；基因敲除

布洛芬是苯丙酸类非甾体抗炎药物的典型代表，属于重要的药物及个人护理品(Pharmaceuticals and personal care products,PPCPs)类物质。在降低和消除其对公众健康及水生环境的危害和潜在风险的研究中，布洛芬的微生物降解备受关注。筛选布洛芬高效降解菌株，从中克隆布洛芬降解基因并从分子水平阐明布洛芬降解机理，可以为布洛芬降解菌剂研发、城市污水脱布洛芬的前期处理以及饮用水源保护区水体中的布洛芬去除提供菌种保障。

Murdoch等[1]首次从污水样品中分离到以布洛芬(500 mg/L)为惟一碳源和能源的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonassp.)菌株Ibu-2，该菌株降解布洛芬的羧酸基侧链先于苯环裂解。近期其又构建了菌株Ibu-2的福斯质粒文库，从该文库中筛选到的阳性克隆菌株pFOS 3G7(简写为3G7)能够降解布洛芬为异丁基邻苯二酚[2]。笔者开展了基于Ibu-2菌株的高效降解布洛芬亚克隆菌株构建以及降解调节因子基因定位研究，力求从分子水平鉴定2个可降解布洛芬的福斯质粒菌株3G7和4F6的间位苯环裂解活性(Meta-cleavage activity)差异。研究结果表明，福斯质粒菌株4F6间位苯环裂解活性显著高于福斯质粒菌株3G7[3]，因此推测菌株4F6有2个邻苯二酚2,3-双加氧酶基因(C23O)。为验证此推测，本研究基于菌株3G7的Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5，利用λ-red同源重组酶质粒pKD46敲除4F6菌株中的C23O基因，构建新的转座子突变体4F6-G9和4F6-H5，分析2个原始出发菌株及各自突变体的间位苯环裂解活性差异，以期为从分子水平深入阐明布洛芬的微生物降解机理奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株和质粒布洛芬福斯质粒文库克隆菌株3G7[2]的Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5，由康奈尔大学微生物系Dr.Anthony G.Hay实验室构建，这2株突变体中的Tn5插入位点在邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因内。本研究所用菌株与质粒见表1。

表 1　本研究所用菌株和质粒

注：Cmr.氯霉素抗性(LB中终质量浓度为12.5 μg/mL)；Ampr.氨苄青霉素抗性(150 μg/mL)；Tetr.四环素抗性(5 μg/mL)。

Note:Cmr.Chloramphenicol resistance (final concentration in LB was 12.5 μg/mL);Ampr.Ampicillin resistance (150 μg/mL);Tetr.Tetracycline resistance (5 μg/mL).

1.1.2主要试剂和仪器布洛芬购自Acros Co. (N.J.,USA)，邻苯二酚购自Sigma Chemical Co. (St. Louis,M.O.,USA)，1 000×拷贝数诱导溶液购自Epicentre Biotechnologies (Madison,W.I.,U.S.A.)，Start PCR Master Mix buffers购自Thermo Scientific Inc.(Waltham,M.A.,USA)，1 kb Marker购自Invitrogen (carisbad,CA)，琼脂糖购自Fisher Scientific Co.(Fair Lawn,N.J.,USA)，ZymocleanTM胶回收试剂盒购自Zymo research公司(Irvine,CA)，其余试剂均来自Fisher Scientific Co.。

MilliQ 纯水制备系统购自Millipore Co.(Bedford,M.A.,USA)，无菌滤膜购自Corning (N.Y.,USA)，Micropulser电击转化仪购自Bio-Rad公司(Hercules,CA)。Synergy HT TM型酶标仪购自Bio-Tek instruments inC.(Winooski,V.T.,USA)。

1.1.3引物本研究设计的邻苯二酚2, 3-双加氧酶(C23O)基因克隆正反向引物(C23O F和C23O R)由Integrated DNA Technologies (IDT) Inc.(Coralville,I.A.,USA)合成。引物序列为C23O F:5′-ATA ATC GCA CGG AAC TCG ACA CCT-3′；C23O R:5′-TCG GTG CGA CCT TCA ATC ATG TCA-3′。使用DNAStar软件搜寻邻苯二酚2, 3-双加氧酶引物的准确位置，确认C23O F位于布洛芬降解基因簇中的663-686 bp处；而C23O R位于1 848-1 871 bp处。

1.2福斯质粒文库克隆菌株3G7 Tn5突变体G9和H5的确认

使用MilliQ 纯水制备系统制备PCR反应试验用纯水，并经0.2 μm无菌滤膜过滤备用。将上述无菌ddH2O分装至离心管，UV灯下灭菌10 min，作为PCR反应所需用水。PCR反应体系为：Start PCR Master Mix buffers 10 μL，C23O F和C23O R引物各1 μL，补足ddH2O至20 μL。加入微量单菌落(分别为3G7 Tn5突变体G9和H5)于PCR反应管中，设不加菌落的PCR反应管为阴性对照，添加pFOS 3G7单菌落的PCR反应管为阳性对照。PCR扩增条件同文献[4]。PCR反应结束后，分别添加5 μL 1 kb Marker和10 μL PCR反应液至1.0%琼脂糖凝胶孔，168 V持续1 h，观察电泳结果以确认突变体中该转座子的存在与否。

1.3重组质粒pKD46的电击转化

首先制备4F6菌株的感受态细胞，具体操作为：转移600 μL 4F6菌株的过夜培养液至5.4 mL LB(Cmr)培养基中，37 ℃培养3 h。将上述培养液分装至1.5 mL离心管，14 000 r/min离心1.5 min, 弃上清，收集细胞，重复离心2次。用1 mL 300 mmol/L的冰冻蔗糖洗涤上述细胞3次，再次悬浮至100 μL冰冻蔗糖中。

添加80 μL制备的4F6感受态细胞和1 μL pKD46质粒至冰冻电击转化杯中，选择1.8 kV电击，迅速加入600 μL LB培养液，30 ℃恢复培养1 h。8 500 r/min离心1.0 min，移去500 μL培养液后将剩余细胞涂布于LB(CmrAmpr)双抗平板上，30 ℃培养，所生长菌株命名为4F6-pKD46。

1.43G7 Tn5突变体中线性DNA的电击转化

使用C23O F和R引物分别扩增3G7 Tn5突变体G9和H5中的线性DNA，具体操作同1.2。切胶后用ZymocleanTM胶回收试剂盒纯化回收样品，1.0%琼脂糖凝胶检测所得纯化线性DNA。

制备菌株4F6-pKD46的感受态细胞，制备过程中首先添加1 000×拷贝数诱导溶液于LB(CmrAmpr)培养液中培养1.5 h，其余操作同1.3中4F6菌株感受态细胞的制备。电击转化方法同1.3，设置2个重复。细胞涂布于LB(CmrTetr)双抗平板上，30 ℃培养，所生长菌株分别命名为4F6-G9和4F6-H5。上述试验重复2次。

1.5重组质粒pKD46的消除

质粒pKD46(Ampr)是温敏型质粒，温度升高至42 ℃时可以较有效地消除该质粒[5]。将出发菌株3G7和4F6转接至LB平板(Ampr)以确认其无氨苄青霉素抗性。之后将1.4所获得的4F6-G9和4F6-H5突变株划线至LB平板(CmrTetr)，42 ℃培养至平板上长出菌落，所生长菌落再次转接至LB平板(Ampr)30 ℃培养。连续划线2次，直到LB平板(Ampr)上无菌落形成。使用C23O F和C23O R引物，菌落PCR再次确认4F6-G9和4F6-H5突变体，菌落PCR的具体操作同1.2。

1.6菌株间位苯环裂解活性的测定

邻苯二酚2,3-双加氧酶催化邻苯二酚外开环即间位裂解，其裂解产物2-羟基粘糠酸半醛(2-HMS)是一种黄色物质，最大吸收波长为375 nm[6-8]，30 ℃下测定375 nm处吸光度增加值可以检测C23O酶活，但此类方法操作繁琐、耗时，操作过程中难以避免酶活损失。本研究在上述测量方法基础上略作改进，使用酶标仪(Multi-detection microplate reader spectrophotometer)同时读取各菌株的OD375和OD600值，连续检测4 h，间隔0.5 h读取数据，采用KC4 V3.4软件分析记录试验数据。

将原始出发菌株3G7和4F6及Tn5转座子插入突变体出发菌株3G7-G9、3G7-H5和本试验构建的4F6-G9、4F6-H5突变体进行间位苯环裂解活性测定。具体测定方法为：分别接种上述菌株的单菌落至16 mL添加不同抗生素的LB培养基中，37 ℃过夜培养；吸取3 mL新鲜培养液再次转接至12 mL LB中，37 ℃培养4 h；9 000 r/min离心10 min，再次悬浮至5 mL LB中。准备2种混合培养液：其一为在5 mL LB中添加5 μL拷贝数诱导溶液(1 000×)和5 μL布洛芬母液；其二为在5 mL LB中添加5 μL拷贝数诱导溶液(1 000×)和5 μL甲醇。将200 μL各细胞悬浮液分别接种至装有2种(500 μL)混合培养液的EP离心管中，每菌株设置3个重复，37 ℃过夜培养，8 500 r/min离心2 min；用1 mL磷酸盐缓冲液重新悬浮细胞，8 500 r/min再次离心2 min，细胞重新悬浮于200 μL磷酸盐缓冲液中；将上述200 μL细胞悬浮液添加至96孔细胞培养板，用磷酸盐缓冲液作1∶10稀释2次，即吸取20 μL原始细胞悬浮液至另一孔中，添加180 μL磷酸盐缓冲液充分混匀，并在各反应孔中添加2 μL底物邻苯二酚(10 mg/mL)；以不添加细胞悬浮液，仅包含180 μL磷酸盐缓冲液和2 μL邻苯二酚的细胞培养板作为空白对照。测定各菌株的间位苯环裂解活性(简写为MC活性)，同时用OD375/OD600和mean V2/OD600表征MC活性，其中mean V2=ΔOD375/ΔT。式中，T为时间。

2结果与分析

2.13G7 Tn5突变体G9和H5的确认

对实验室已经构建的Tn5转座子插入突变株3G7-G9、3G7-H5的突变体进行Tn5插入片段检测，以确认突变体中该转座子的存在与否。使用C23O F和C23O R引物PCR扩增存在于Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5中的C23O基因，据此确认所构建菌株3G7-G9和3G7-H5中确实存在Tn5插入片段，结果见图1。

图 1　3G7 Tn5突变体G9和H5的确认

图1显示，3G7菌株扩增出的C23O基因大约1.0 kb(泳道6)，从突变体3G7-G9和3G7-H5中扩增出的C23O基因在2.0～3.0 kb(泳道1-4)，阴性对照(泳道5)无扩增条带。对比福斯质粒文库克隆菌株3G7中的C23O基因，Tn5转座子插入导致突变体菌株中扩增出的C23O基因增加了1.0 kb多，证明Tn5确实存在于出发突变体菌株中。另外，已经确认3G7菌株中C23O基因在布洛芬降解基因簇中位于844-1 718 bp，Tn5插入位点在1 500 bp处，且Tn5的片段长度约为1 100～1 200 bp(研究结果未发表)，这与图1检测结果相符。

2.24F6-G9和4F6-H5菌株的构建

制备福斯质粒克隆菌株4F6的感受态细胞后，将λ-red同源重组酶质粒pKD46高压电击转化至福斯质粒克隆菌株4F6的感受态细胞中，于LB(CmrAmpr)双抗平板筛选到阳性转化子4F6-pKD46若干，挑选8株单克隆4 ℃保存备用。

PCR扩增出的3G7 Tn5突变体G9和H5中的线性DNA条带大小均在2.0～3.0 kb。分别合并3G7 Tn5突变体G9和H5 样品，再用ZymocleanTM胶回收试剂盒浓缩提纯该线性DNA。将PCR获得的3G7-G9和3G7-H5线性DNA，高压电击转化至感受态受体细胞4F6-pKD46，筛选新的阳性转化子4F6-G9和4F6-H5菌株，2批试验分别均得到了阳性转化子4F6-G9和4F6-H5菌株(表2)，第1批试验30 ℃培养56 h，突变体4F6-G9克隆数较多；第2批试验30 ℃培养38 h，阳性转化子4F6-H5克隆数居多。

表 2　LB CmrTetr双抗平板上4F6的Tn5突变体克隆数

注：克隆数分别为2个平板上的数据,2次试验所挑选的4F6突变体在42 ℃培养。

Note:Colony numbers are the numbers in the two plates.All selected 4F6 mutants from two tests were incubated at 42 ℃.

2.34F6-G9和4F6-H5突变体的确认

突变体4F6-G9和4F6-H5消除pKD46质粒1次后，用C23O F和C23O R引物进行菌落PCR确认4F6-G9和4F6-H5突变体，结果见图2。图2显示，质粒消除1次后，4F6-G9和4F6-H5中扩增所得C23O基因大小为1～1.6 kb(lane 2-4)，阳性对照4F6菌株中约为1.0 kb。借助来自pKD46质粒的λ-red同源重组酶，Tn5片段同源重组(敲除)取代了部分C23O基因，但是重组结合于4F6受体菌中的该Tn5片段可能小于位于C23O基因内的被取代片段，因此该条带并未出现在2.0～3.0 kb内。42 ℃下pKD46质粒被消除2次后，Ampr平板上无菌落形成。初步表明已经成功消除了4F6 Tn5突变体内的质粒pKD46。

以4F6-G9和4F6-H5为模板的PCR检测结果(图3)表明，扩增出的C23O基因与阳性对照3G7-G9和3G7-H5均在2.0～3.0 kb，结合LB抗性平板试验，可以推断借助pKD46质粒的λ-red同源重组酶，将转座子Tn5从福斯质粒文库阳性克隆菌株3G7电击转化至另一克隆菌株4F6，并且消除了pKD46质粒，敲除了4F6菌株中的C23O基因，构建获得了4F6-G9和4F6-H5突变体。

图 2　pKD46质粒消除1次后4F6 Tn5突变体的PCR确认

2.4突变体菌株间位苯环的裂解活性

将原始出发菌株3G7和4F6及Tn5转座子插入突变体出发菌株3G7-G9、3G7-H5和本试验构建的4F6-G9、4F6-H5突变体进行间位苯环裂解活性测定。测定结果见图4。

图 4　供试菌株的间位苯环裂解活性分析

福斯质粒文库克隆菌株4F6的MC活性高于菌株3G7，添加布洛芬诱导后，4F6的MC活性明显高于3G7。4株突变株的MC活性均比出发菌株3G7和4F6低，添加布洛芬诱导后结果相同(图4)。4株突变株OD375/OD600值几乎与3G7出发菌株相同(图4B)。上述数据表明，从原始出发菌株4F6敲除C23O基因后所构建的4F6突变株几乎具有与3G7 突变株相同的MC活性。尽管4F6-G9菌株比3G7-G9菌株MeanV2/OD600值略高(图4A)，但仍低于出发菌株3G7的MeanV2/OD600值。

结合PCR检测结果(图3)可以推断，4F6菌株中仅有1个C23O基因。之前提出的4F6可能有2个C23O基因的假设[3]不成立。这意味着需将研究重点集中于寻求3G7和4F6菌株中可能存在的不同正或者负调控因子。

3讨论

基因敲除是20世纪80年代后期基于DNA同源重组原理发展起来的一门新技术，微生物基因敲除的传统方法是利用其自身的RecA重组系统。RecA重组系统是由RecA和RecBCD组成的E.coli内源性同源重组机构[9]。Murphy[10]首先利用噬菌体λ的重组功能，采用线性dsDNA构建了重组分子，此结果拉开了用噬菌体λ的Red重组系统在E.coli中快速敲除原核基因研究工作的序幕。Red重组需要2个基因：redα与redβ。基因α产物是作用于线性双链DNA的5′-3′外切酶；基因β产物结合于单链 DNA上，激发互补链退火，但不能促进DNA链的插入和自身交换[11-12]。噬菌体λ编码的Gam蛋白抑制了宿主细胞中RecBCD的活性，从而辅助redα与redβ产物的重组功能[13]。Murphy等[10,14]研究表明，λ-Red介导的重组率比RecA重组系统高10～100倍，因为被引入受体的噬菌体编码的蛋白质促进了同源重组，Red同源重组操作在E.coli以及其他细菌菌株中均是可行的。

目前，许多研究者广泛使用Red同源重组系统[15-20]，在微生物代谢工程领域，应用Red同源重组技术敲除生物代谢途径中的关键基因，构建突变体菌株，改变其代谢流分布，从而构建新的代谢途径。研究者们利用Red同源重组技术敲除了大肠杆菌的葡萄糖转运基因ptsG，分别构建了ptsG基因缺陷株DH5aP、JM109P[15]以及SZ470P[16]。薛可等[18]利用该系统成功敲除了CSN2质粒上的β酪蛋白基因的编码区，为制作转基因动物及乳腺生物反应器的研究提供了可能。曲璟秋等[20]利用大肠杆菌BW25113单基因缺失体Keio文库，将经典的Red同源重组技术与P1噬菌体转导技术相结合，对E.coliMG1655脂肪酸代谢基因进行快速敲除，获得了大肠杆菌缺失菌株，简化了构建大肠杆菌单基因和多重突变体的方法。Fu等[21]报道了一种基于RecET的直接克隆技术结合高通量DNA测序技术的研究方法，发现Red体系和RecET体系有着本质区别：即Red体系对于催化线性分子和环状分子之间的重组更为有效，而RecET体系能高效地催化两个线性DNA分子的同源重组。

应用Red系统进行基因敲除可直接利用线性打靶DNA，两侧同源臂长度为35～60 bp时即可发生同源重组且重组效率高。本试验以3G7的Tn5转座子插入突变株为出发菌株，借助Red同源重组系统，使得菌株4F6的C23O基因插入失活，成功构建了4F6-G9和4F6-H5突变体。本研究尽管是利用传统的DNA同源重组系统，但是仍然准确便捷地敲除了菌株4F6的邻苯二酚2,3-双加氧酶基因，构建了其Tn5转座子插入突变体。该结果再次印证了“Red体系对于催化线性分子和环状分子之间的重组更为有效[21]”的观点。由于同源重组发生在细胞内，大肠杆菌的复制、修复系统保证了克隆分子完全忠实于亲代分子，因此该技术是传统基因工程与PCR技术的一种很好的补充[18]。本研究为布洛芬降解基因克隆、降解调节因子的基因定位提供了可供选择的简便方法，亦为从分子水平阐明布洛芬的微生物降解机理奠定了基础。

志谢：感谢国家留学基金委资助开展本研究的部分试验内容，感谢康奈尔大学微生物系副教授Dr.Anthony G.Hay提供菌株和质粒等研究材料。

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Construction of transposon insertion mutants for ibuprofen degradable cloning strains from Fosmid Library

WEI Ya-hong1a,1b,1c,DUAN Min1a,XIANG Zhao-ju2,QU Dong1d,WANG Yao1a

(1 aCollegeofLifeSciences,bStateKeyLaboratoryofCropStressBiologyforAridAreas,cBiomassEnergyCenterforAridandSemi-AridLands,dCollegeofNaturalResourcesandEnvironment,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2CollegeofLifeSciences,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an,Shaanxi710062,China)

Abstract:【objective】 The C23O gene was knocked out from ibuprofen clone strain 4F6 and its Tn5 transposon insertion mutants were constructed to provide basis for understanding factors affecting ibuprofen degradation.【Method】 Tn5 transposon was transferred from clone 3G7 to 4F6 through electroporation mediated with λ-red homologous recombinase of pKD46 plasmid.After curing pKD46 plasmid and knocking out C23O gene from 4F6,the meta-cleavage activities of Tn5 mutants of 3G7-G9,3G7-H5,4F6-G9 and 4F6-H5 were measured and compared. 【Result】 The Tn5 mutants of 4F6-G9 and 4F6-H5 were constructed after curing pKD46 plasmid at 42 ℃.No significant differences among Tn5 mutants (3G7-G9,3G7-H5,4F6-G9,and 4F6-H5) were observed from meta-cleavage activity assays.4F6 had higher meta-cleavage activity than 3G7 during the ibuprofen and non-ibuprofen treatments.Since there was only one C23O gene,the meta-cleavage activity differences between strains 3G7 and 4F6 may due to ibuprofen degradation regulators.【Conclusion】 This research provides a simple and efficient method to target and knockout C23O gene.

Key words:ibuprofen degradable fosmid;Tn5 mutants;gene knockout

DOI：网络出版时间:2016-03-1408:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.04.019

[收稿日期]2014-08-21

[基金项目]国家自然科学基金面上项目(31070453)；陕西省国际科技合作项目(2013KW-29)；西北农林科技大学科技创新专项(QN2011113)；西北农林科技大学国际科技合作项目(A213021311)

[作者简介]卫亚红(1973-)，女，陕西扶风人，副教授，硕士生导师，主要从事环境微生物学研究。

[中图分类号]Q933

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)04-0135-07

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160314.0845.038.html

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