免疫组织化学二步法检测原发性肝癌组织GP73蛋白表达的结果分析

崔雪平

免疫组织化学二步法检测原发性肝癌组织GP73蛋白表达的结果分析

崔雪平

目的 分析原发性肝癌组织GP73蛋白表达的结果。方法 选取手术切除原发性肝癌组织的患者35例，采用免疫组织化学二步法检测31例原发性肝癌组织、28例癌旁组织、10例肝硬化肝组织和11例正常肝组织的GP73蛋白的表达。结果 GP73蛋白表达主要位于肝癌组织、癌旁组织、肝硬化肝组织的细胞中，其细胞质会出现黄色、棕黄色、黄褐色的着色颗粒。在肝癌组织中，GP73阳性率为93.5%(29/31)；在癌旁组织中，GP73阳性率为92.9%(26/28)；在肝硬化肝组织中，GP73阳性率为40.0%(4/10)；在正常肝组织中，GP73阳性率为27.2%(3/11)。在GP73蛋白阳性表达率方面，肝硬化肝组织与正常肝组织差异无统计学意义；肝癌组织相比与癌旁组织差异无统计学意义；与肝硬化肝组织和正常肝组织相比，肝癌组织和癌旁组织的GP73蛋白的阳性表达率更高，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 GP73蛋白是肝癌组织病理标志物，可以作为肝癌诊断的标记蛋白。

原发性肝癌组织；免疫组织化学二步法；GP73蛋白；表达

原发性肝癌是世界上最常见的一种消化系统恶性肿瘤，病死率很高，对人们的身体健康和生命安全均产生了极大的威胁。在我国，原发性肝癌的致死率一度超过45%[1]，且呈现出东南沿海地区发病率高，欠发达地区发病率低，男性患病率高，女性患病率低的特点。尽管病因和发病机制并未确定，但早诊断、早发现、早治疗能达到良好的临床疗效。文献报道，在发生病变的肝细胞中，GP73表达会明显升高[2]，相对于AFP，GP73诊断肝癌更加灵敏和准确。本研究以31例原发性肝癌组织、28例癌旁组织、10例肝硬化肝组织和11例正常肝组织为例进行论述，分析原发性肝癌组织GP73蛋白表达的结果。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年6月～2014年7月在尉氏县人民医院手术切除原发性肝癌组织的患者35例，其中胆管细胞型肝癌患者20例，肝细胞肝癌患者15例，该组患者的病情均经病理证实，均符合《原发性肝癌诊疗规范》的诊断标准[3]，31原发性肝癌组织，并于肝癌组织2cm以内取癌旁组织，癌旁组织镜下未见癌细胞，共28例。选择2013年6月～2014年7月在本院接受治疗的13例肝硬化患者，取肝硬化肝组织，共10例；选择

2013年6月～2014年7月在本院接受治疗的12例外伤性肝破裂患者，取正常肝组织，共11例。

1.2 方法 采用免疫组织化学二步法对原发性肝癌组织GP73蛋白表达进行检测。利用10%甲醛溶液、石蜡，经过一列的处理，把新鲜组织制成4μm厚连续切片。具体步骤如下：（1）用二甲苯和梯度乙醇对切片进行脱蜡处理，并进行自来水清洗，PBS清洗3次；（2）利用微波炉和

EDTApH=9.0抗原修复液进行抗原修复处理，然后在常温环境下冷却0.5h，最后PBS清洗3次；（3）去离子水孵育在3%H2O2中进行，10min后用PBS清洗3次；（4）37℃烤箱孵育；（5）滴加辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，放入烤箱，调至37℃进行孵育，2/3h后取出并用PBS清洗3次；（6）使用DAB显色液进行显色处理；（7）使用自来水洗涤干净后，然后进行复染、脱水、胶封；（8）利用PBS进行阴性对照。

1.3 观察指标 观察指标主要是阳性细胞百分数和细胞质染色。细胞质染色：黄色得1分，棕褐色得3分，无色不得分，棕黄色得2分。阳性细胞百分数：≤10%不得分，11%～50%得1分，51%～75%得2分，≥76%得3分。两项得分相加：4～6分为强阳性，2～3分为阳性，0～1分为阴性。

2 结果

2.1 GP73蛋白的表达情况 GP73蛋白表达主要位于肝癌组织、癌旁组织、肝硬化肝组织的细胞中，其细胞质会出现黄色、棕黄色、黄褐色的着色颗粒。

2.2 不同组织中的GP73阳性率比较 在肝癌组织中，GP73阳性率为93.5%(29/31)；在癌旁组织中，GP73阳性率为92.9%(26/28)；在肝硬化肝组织中，GP73阳性率为40.0%(4/10)；在正常肝组织中，GP73阳性率为27.2%(3/11)。见表1。在GP73蛋白阳性表达率方面，肝硬化肝组织与正常肝组织差异无统计学意义；肝癌组织相比与癌旁组织差异无统计学意义；与肝硬化肝组织和正常肝组织相比，肝癌组织和癌旁组织的GP73蛋白的阳性表达率更高，差异有统计学意义(P＜0.05)。

组别例数阳性例数阳性率(%)肝癌组织312993.5癌旁组织282692.9肝硬化肝组织10440.0正常肝组织11327.2

3 讨论

转移早、手术后复发率高、进展快、生存期短、预后差是原发性肝癌最主要的临床特点。我国是肝癌发生率较高的国家，肝癌的临床治疗和研究已经给我国医疗资源带来了沉重的负担。原发性肝癌可历时20～50年，由慢性肝炎慢慢发展成肝硬化并最终恶化成肝癌。对于原发性肝癌的治疗，早诊断、早发现非常重要，能显著提升患者的生存率，改善预后。

在之前，甲胎蛋白（AFP）是肝细胞肝癌的主要血清标志物，但是其敏感性并不是非常理想，在报道中由39%～65%，平均水平大约在50%[4]，然而在实际的临床医疗中，部分早期肝癌患者仍然无法得到早期诊断和治疗。

有研究发现人巨细胞性肝炎的过程中发现了一种编码基因全长达3042bP的跨膜糖蛋白[5]。该蛋白本身位于高尔基体顺面膜囊上，在细胞质中呈点状分布，其编码基因位于第9号染色体的长臂上，由于相对分子质量是7.3×104，所以该跨膜糖蛋白被命名为GP73。最初的研究指出，GP73很少在正常的肝细胞中表达，多见于人类正常组织的上皮细胞。后来有学者指出，病变或癌变组织的GP73表达明显高于正常组织，将可能成为更好的诊断肝癌尤其是早期肝癌的血清标志物[6]，因此而成为GP73开始成为肝癌临床治疗的一个重要研究方向。

本研究结果显示，正常肝组织、肝硬化肝组织、癌旁组织、肝癌组织的GP73阳性表达率分别为27.2%、40.0%、92.9%、93.5%，呈现一个逐步上升的趋势，其中正常肝组织、肝硬化肝组织处于一个轻微表达的阶段，癌旁组织、肝癌组织处于一种高度表达的阶段，也可能是因为原发性肝癌与GP73之间有一个相互促进机制。

相关研究表明，GP73的表达多发生于正常组织的上皮细胞中，而在正常肝脏组织中，除了汇管区周围的胆管上皮细胞，肝脏组织的其它细胞是不会表达GP73的[7]。而表达GP73的胆管上皮细胞也是非常少的，呈点状分布于细胞质中。随着进一步的研究，人们发现发病的或者癌变的组织细胞中，GP73的表达率是非常高的。在McMahon的研究中[8]，相对于肝硬化及健康两个对照组，实验组PHC患者血清GP73水平明显升高，说明GP73具有一定的辅助诊断价值。在国外，由于受到苛刻的道德伦理限制，国外很少使用人体肝癌组织进行GP73蛋白表达的研究，对肝癌组织和肝硬化肝组织中GP73蛋白更是少之又少，并且即使是有所研究，也大多都局限于免疫组织化学水平。但是到目前为止，还没有关于肝癌组织、对应的癌旁组织还有正常的肝组织中GP73蛋白和MRNA的表达方面的报道，也没有相关研究报道GP73蛋白及mRNA的表达情况与肝癌患者临床病理还有预后等方面之间联系的研究，除此之外，也没有相关研究来阐明GP73在肝癌发生发展中的作用机制及其与肝癌的因果关系等方面。

本研究结果显示，在29例原发性肝癌组织的细胞中GP73的表达呈阳性或强阳性，并在癌细胞质中能发现黄色、黄褐色的染色颗粒，占总数的93.5%(29/31)；在26例癌旁组织的细胞中GP73的表达呈阳性，并在癌细胞质中能发现以黄褐色为主的染色颗粒，占总数的92.9%(26/28)；肝硬化肝组织和正常组织的染色阳性更弱。也就是说，相对于肝硬化肝组织和正常肝组织，肝癌组织和癌旁组织中的GP73表达阳性率更高。

综上所述，采用免疫组织化学二步法检测原发性肝癌组织GP73蛋白表达，GP73蛋白对肝癌的诊断提供了新的方法，能有效地标记原发性肝癌组织细胞。

[1] 高万军，祁楠.原发性肝癌组织中OPN、GP73的表达变化及意义[J].山东医药，2014，54(2)：60-61.

[2] 邓菲丹，郑定容.GP73、AFP-L3在原发性肝癌腹腔积液中的表达及其临床意义[J].现代诊断与治疗，2015(6)：1372-1374.

[3] 中华人民共和国卫生部.原发性肝癌诊疗规范(2011年版)[J].临床肿瘤学杂志，2011，16(10)：929-946.

[4] 叶佩灵，何欣欣，吴晓蔓，等.原发性肝癌组织中GP73蛋白的表达[J].广东医学，2014，35(2)：234-236.

[5] 胡劲松.血清GP73对原发性肝癌诊断的实验研究[D].长沙：中南大学，2010.

[6] 高万军，祁楠.原发性肝癌组织中OPN、GP73的表达变化及意义[J].山东医药，2014，54(2)：60-61.

[7] 赛文莉，陈雯，姚登福，等.联合检测Ang-2和GP73对原发性肝癌诊断与鉴别的临床价值[J].世界华人消化杂志，2015(25)：4032-4040.

[8] McMahon B,Block J,Block T,et al.HePatitis-Associated Liver Cancer：GaPs and OPPortunities to ImProve Care[J].Journal of the National Cancer Institute,2016,108(4)：104-105.

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.18.019

河南 475500 尉氏县人民医院检验科（崔雪平）