大肠杆菌诱导30代后对环丙沙星耐药性的变化试验

付赛赛，付冉冉，李进福

(1.河南省郑州市河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450002；2.河南省商丘市医学高等专科学校护理系)



大肠杆菌诱导30代后对环丙沙星耐药性的变化试验

付赛赛1，付冉冉2，李进福1

(1.河南省郑州市河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450002；2.河南省商丘市医学高等专科学校护理系)

摘要：为探究诱导30代后的大肠杆菌对环丙沙星的耐药性变化，为临床控制致病性大肠杆菌病提供参考。使用环丙沙星对8株“耐药菌”进行诱导培养，将1/2 MIC作为初始诱导浓度。挑取每隔5代的菌株，并在每个原有菌株编号下标5、10、15、20、25、30表示诱导代数，共得到诱导培养菌株60株，用于诱导菌株外排表达量的测定。结果表明：部分菌株在第5代时，MIC值已经增加1倍，部分菌株至30代时，MIC值才发生变化，其最大值增加至原来的8倍，多数为原来的2～4倍。

关键词：大肠杆菌；环丙沙星；耐药基因

大肠杆菌病是由大肠埃希氏菌引起的人兽共患病，最早从婴儿粪便中分离获得，被认为是非致病菌。直到十九世纪中叶，科学家逐渐认识到一些特殊血清型的大肠杆菌具有病原性，主要引起婴幼儿及幼畜、雏禽的腹泻和败血症。1894年，首例报道大肠杆菌可引起禽类的大批死亡，并从心、肝、脾中分离到大肠杆菌[1-2]。

大肠杆菌病是人兽共患的常见原发或继发性细菌病，对人畜健康危害极大，抗菌药物在这类疾病的防控中发挥着非常重要的作用。近年来，由于长期滥用抗菌药物，造成了大肠杆菌耐药菌株的不断产生，在兽医临床上已出现多重耐药性、超强耐药的大肠杆菌(即同时对兽医临床常用抗菌药物，如β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类和氟喹诺酮类等产生耐药性)，常可导致常规药物的药效下降甚至消失，临床可供选择药物大幅减少，给人类健康带来严重威胁[3]。主动外排系统是微生物产生多重耐药性的一个重要机制，能够介导药物的外排，阻止抗菌药物在菌体内的集聚。目前，对主动外排系统的研究已成为国内外研究热点之一[4-5]。本试验对临床分离的8株大肠杆菌进行了药敏试验，用微量肉汤稀释法测定了分离菌对临床常用药物——环丙沙星的敏感性，找出主动外排相关靶基因，为防控大肠杆菌的合理用药及防止耐药菌株的传播提供重要理论依据。

1材料与方法

1.1实验菌株8株大肠杆菌由河南农业大学禽病研究所分离、鉴定、保存及耐药性检测，标记编号分别为1、045、94、048、017、T7、035、040。

1.2试剂及仪器环丙沙星(98.0%)由河南某兽药公司提供，MH培养基(肉汤)，ddH2O，麦康凯琼脂均购自某医药有限公司。

1.3细菌处理

1.3.1细菌复苏无菌操作台下接菌，37℃恒温培养过夜，观察平皿板上细菌生长情况，根据细菌形态和性状初步判断是否为目的细菌。挑单个菌落接种于不加药物的MH肉汤，37℃水域恒温水浴震荡培养过夜，然后接种于麦康凯培养基上鉴别细菌，得到的细菌液保存备用并标记为0代菌。

1.3.2细菌诱导将1/2 MIC的CIP作为初始诱导浓度。37℃恒温培养18～24 h，即为1代，连续共传30代，传代过程中，每隔5代测定MIC，并调整MH肉汤中的药物浓度，使之始终保持1/2MIC。并将诱导菌液划线于麦康凯培养基，观察菌落形态及是否污染有杂菌。若在传代过程中菌株生长不良，则使用上代菌株在无药物状态下使细菌生长，但不计代数，然后加入1/2MIC药物继续传代。挑取每隔5代的菌株，并在每个原有菌株编号下标5、10、15、20、25、30表示诱导代数，共得诱导培养菌株60株，用于诱导菌株外排表达量的测定。

1.4药液配置将称量好的药品用高压灭菌去离子水配制成浓度为2560 μg/mL的药液，分装时使用注射器和0.25 μm滤头分装至1.5 mL EP管中置-20℃保存(保存时间长，随用随取)。

1.5最小抑菌浓度测定按照肉汤稀释棋盘法(参照MIC)测定。具体方法如下，将1到6排第1孔分别加入50 μL(512 μg/mL)环丙沙星，分别加入50 μg/mL菌液，将1～6排从左到右进行倍比稀释，第1～6排1～6孔中，环丙沙星浓度依次为256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL。用同样方法将每株细菌每种药物重复三次，对比结果观察是否出现重现性。参考CLSI抗菌药物敏感性试验标准[6]，当质控菌符合规定的药敏范围时，对供试菌的MIC值进行判读。当出现单一跳孔时，参照平行操作结果记录抑制细菌生长的最高药物浓度，如多次出现跳孔现象，必须重新操作。

2结果与分析

2.1细菌鉴定结果第30代菌株在 MH肉汤中过夜培养后可见肉汤出现不同程度的混浊。第30代菌株在麦康凯培养基上形成桃红，扁平，圆形，隆起，光滑，湿润菌落，与资料描述中大肠杆菌在麦康凯培养基上生长性状基本一致，故鉴定为大肠杆菌[7]。

2.2最小抑菌浓度(MIC)测定结果详见表1。由表1可见，经过30代诱导，环丙沙星对所有菌株MIC都发生了不同程度的改变，其中菌株1、T7在第5代时，耐药性变强，MIC值已经增加1倍；环丙沙星对035菌株第10代MIC即发生改变，而菌株040至第30代才发生改变。从以上试验可以看出不同菌株对环丙沙星耐药性不同，环丙沙星的诱导可以改变菌株的 MIC，诱导可使耐药菌株的耐药性更强。由于这些菌株本身即为耐药性较强的菌株，诱导后可使MIC值最大增加为原来的8倍(T7)，多数为原来的2～4倍。

表1　乳酸环丙沙星对大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)

3小结与讨论

试验研究首先使用1/2MIC环丙沙星对耐药菌株进行诱导培养，给耐药菌株造成抗生素生存压力，导致菌株的耐药性更强，MIC值相应增加。部分菌株在培养至5代、10代时，即适应了较高的环丙沙星浓度，耐药性增加，表现为MIC升高，外排基因表达量增加，则可能出现与环丙沙星耐药性有关的其它机制变化，比如靶位突变；产生 aac(6′)-Ⅰb-cr酶等[8]。

部分适应较慢菌株培养至25代、30代时，MIC才出现明显变化。部分菌株MIC增加8倍，多数为增加2～4倍。部分主动外排基因增加非常明显，达到了原代菌株的数倍，甚至数百倍，部分菌株虽然耐药性增加，但主动外排基因表达则反而下降，这可能与菌株之间的个体差异有关，有待进一步研究探讨。参考文献

[1]陆承平.兽医微生物学(第二版)[M].北京:中国农业出版社,2001.

[2]陈溥言，王川庆.兽医传染病学(第五版)[M].中国农业出版社，2006.

[3]汤电，郭玉芳，王丽华，等. 食品动物源大肠杆菌多重耐药性监测[J].中国畜牧兽医,2011,38(4):182-185.

[4]张卓然,夏梦岩,倪语星.微生物耐药的基础与临床[M].北京:人民卫生出版社,2007.

[5]Keith Poole, Efflux-mediated antimicrobial resistance[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2005,56,20-51.

[6]CLSI. performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 20th informational supplement, M100-S20[S]. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institude, 2010.

[7]王兵, 苪艺. 鸡大肠杆菌地区菌株的分离鉴定与药敏试验[J]. 家畜生态报,2006,27(2):73-75.

[8]刘建华. 鸭源大肠杆菌主动外排基因及其调控基因的表达水平与多重耐药机制[D].河南农业大学,2011.

收稿日期：2015-11-20

作者简介：付赛赛(1991.9-)，女，在读硕士，E-mail:546251799@qq.com

中图分类号：S852.61+2

文献标识码：A

文章编号：1005-7307(2016)03-0004-002