川芎嗪对脓毒症大鼠心肌抑制干预作用的研究

李　健，张　俭

川芎嗪对脓毒症大鼠心肌抑制干预作用的研究

李健，张俭

广东省中医院大学城医院重症医学科(广州 510000)，E-mail：jacky791121@163．com

摘要：目的研究川芎嗪对脓毒症大鼠心肌抑制的干预作用。方法27只 SD 大鼠随机分为假手术组(Sham组)、模型组(CLP组)、川芎嗪组(TMP组)，每组9只，在造模后72 h用心脏超声检测大鼠的心功能，检测心肌损伤标记物以及炎症介质高迁移率族蛋白B1(HMGB1)。结果与Sham组比较，在造模72 h，CLP组大鼠左室射血分数(LVEF)值降低，差异有统计学意义(P<0．05)，而大鼠给予TMP后可提高LVEF值水平，与CLP组比较差异有统计学意义(P<0．05)。同时，TMP组大鼠心肌损伤标记物心肌肌钙蛋白T(TnT)以及炎症介质HMGB1较CLP组也明显减轻(P<0．05)。结论 川芎嗪有抑制炎症反应，改善脓毒症大鼠心肌抑制的作用。

关键词：脓毒症；心肌抑制；川芎嗪；心肌标志物；高迁移率族蛋白B1；大鼠

脓毒症(sepsis)心肌抑制(sepsis myocardial dysfunction，SMD)是指脓毒症发生双心室的扩大和射血分数的降低。其临床发生率可达60%，心输出量可升高或正常[1]。SMD是脓毒症死亡的重要原因，心脏作为受累器官之一，其功能受损与脓毒症病死率升高密切相关。因此研究脓毒症心功能障碍的病理机制意义重大，改善脓毒症心肌功能障碍，能够一定程度降低脓毒症病死率。脓毒症心肌抑制的发病机制目前仍不清楚。现在研究认为心肌抑制物质在脓毒症心肌抑制中具有重要作用。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box- 1，HMGB1)是一种重要的炎性介质，能够通过调节细胞膜钙离子内流，影响心肌细胞收缩力[2]。

由此，推测随着脓毒症炎症级联反应的扩大，HMGB1的大量产生加重了脓毒症心功能障碍。而干预HMGB1成为治疗脓毒症心肌抑制的潜在靶点。

川芎嗪具有抗凝、抗血小板聚集、抑制炎症反应的作用，被广泛应用于心脏疾病的治疗。本研究采用盲肠结扎穿刺术(CLP) 制备大鼠脓毒症模型，观察川芎嗪注射液对脓毒症大鼠心功能障碍的保护作用，并初步探讨其作用机制，为寻找中医药防治脓毒症并发心功能障碍的有效途径提供参考依据。

1材料与方法

1．1动物模型制备SPF级雄性SD大鼠，体质量( 220±20) g，购自广东省医学实验动物中心。仿照Rittirsch等描述的方法，复制CLP脓毒症模型[3]。大鼠适应环境1周，术前禁食12 h，以水合氯醛(3．5 mL/kg)麻醉后，于腹前正中作长约2 cm切口，游离肠系膜和盲肠，以30号丝线环形结扎盲肠根部，结扎完毕应仔细检查，保持肠道通路正常。在与肠系膜相对的盲肠肠壁浆膜面用18号针头穿刺2处。针孔之间相距约1 cm。轻轻挤压肠管使粪便自穿刺点溢出，还纳肠管，逐层缝合关腹。术毕腹壁皮下注射生理盐水5 mL/100 g，进行液体复苏。术后自由进食食水。

1．2动物分组及给药27只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组(Sham组)、模型组(CLP组)、川芎嗪组(TMP组)，每组 9只。Sham组除不结扎和穿刺盲肠，余同CLP组；CLP组采用盲肠结扎并穿刺法造模，术后给予皮下注射生理盐水(10 mL/kg) 进行复苏，1 次/日；TMP组造模后立即皮下注射川芎嗪注射液(10 mg/kg) ，1次/ 日，99% 高纯度川芎嗪粉末(南京泽朗医药科技有限公司) 用生理盐水溶解至 10 mg/mL 备用。

1．3心脏超声检测心功能使用超高分辨率小动物彩色多普勒(Vevo2100，探头频率为 12 MHz)。在CLP造模后72 h 分别检测大鼠的心功能。腹腔注射 10% 水合氯醛( 3．5 mL/kg) 麻醉，仰卧位固定，胸部备皮，探头置于左胸，取胸骨旁左室长轴、心尖两腔及心尖四腔切面，由二维图像引导取 M 型曲线进行测量，分别测量大鼠心脏射血分数(LVEF)、左室短轴缩短分数(FS、左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVDSd)、室间隔(IVS)活动度、心输出量(CO)以及心率(P)等。每组数据均采连续3 个心动周期的平均值。

1．4血清标本采集和保存假手术组、模型组、川芎嗪组大鼠于制模72 h后采集标本。标本留取方法：麻醉、常规消毒动物腹部皮肤，无菌打开腹腔，分离腹主动脉。从腹主动脉采取所有血，放置普通玻璃试管，离心(3 000 r/min，15 min)分离血清，置EP管，各标本留取两份，-20℃贮存。无菌取出所有实验大鼠心脏，4℃冷生理盐水冲洗，用液氮迅速冷冻后置于-80℃冰箱保存。

2结果

2．1大鼠模型评定大鼠造模前精神未见异常，喜动，自由进食及饮水，鼠毛光滑、有光泽，大便成形条状如常。CLP组12 h大鼠体温升高，出现活动减少等表现。CLP组24 h表现为倦缩俯卧，饮水减少，鼠毛明显枯燥，大便清稀不成形，CLP组48 h表现为萎靡。从实验动物表现来看，符合SIRS到Sepsis的发展过程。而TMP组在造模12 h～72 h，大鼠精神较前稍差，活动较前稍有减少，能自由进食和饮水，鼠毛明显枯燥，灰白无光泽，大便尚能成形，72 h时接近Sham组。Sham组无变化。按照CLP大鼠模型的诊断标准，在造模后12 h～24 h，选择脏器功能较差的数据作为评定。结果显示，造模后12 h大鼠的体温下降，呼吸、心率升高，与Sham组比较均有统计学意义(P<0．05)，提示CLP大鼠出现炎症表现，符合脓毒症动物模型。

2．2大鼠心功能变化造模72 h后，与Sham组比较，CLP组 LVIDd、LVIDs增大，LVEF以及FS降低，其中LVIDs差异具有统计学意义( P<0．05)。详见表1。

在TMP组，腹腔注射TMP后，72 h与CLP同时点比较皆表现出LVIDd、LVIDs增大，LVEF及FS活动度升高。其中LVEF比较有统计学意义(P<0．05)，提示TMP可有效改善CLP大鼠心脏心肌活动从而改善心功能。

3组代表性心脏彩超图像详见图1。

假手术组　　　　　　　　　　　模型组　　　　　　　　　　　　川芎嗪组

组别nLVIDd(mm)LVIDs(mm)LVPWd(mm)LVPWs(mm)LVEF(%)FS(%)Sham组 97.125±0.3324.340±0.4391.766±0.1602.694±0.33468.9±4.2537.5±3.28CLP组 98.270±0.6105.448±0.4801)1.824±0.2092.453±0.19257.9±5.6631.3±3.19TMP+CLP组96.443±0.5343.651±0.4061.959±0.1542.644±0.211 65.9±4.422)36.6±3.28 注:LVIDd为左室后壁厚度;LVIWs为左室壁相对厚度。与Sham组比较,1)P<0.05;与CLP组比较,2)P<0.05。

2．3心肌损伤标志物以及HMGB1水平造模后72 h，CLP组及TMP组TnT及HMGB1较Sham组升高，具有统计学意义(P<0．05)，提示CLP大鼠存在心肌损伤以及炎症反应损伤。TMP组大鼠72 h TnT及HMGB1水平低于CLP组，存在统计学意义(P<0．05)。提示TMP对CLP大鼠心肌抑制有一定改善作用。详见表2。

表2　脓毒症大鼠CLP造模后心肌损伤标记物

3讨论

在脓毒症早期就有心肌的器质性损伤，而且脓毒症时心肌损伤发生越早，进行性恶化的程度越重，病死率就越高，早发的心肌损伤常常是难治性休克的先兆，死亡率会明显增加[4]。加强脓毒症心功能障碍的防治具有重要的临床意义。Parker等[5]观察到脓毒症心功能障碍病人具有早期出现射血分数降低及左室舒张末容积增加的特点。

本实验通过心脏超声检测大鼠心功能，与Sham组比较，CLP造模后心功能主要表现为心肌收缩力下降以及左心室扩大，这和Parke等[5]的观察一致，符合脓毒症高排低阻的血流动力学特点。

前期研究发现，在光学显微镜下观察到脓毒症大鼠心肌发生重度炎症反应，心肌细胞发生变性、坏死，电镜下观察到心肌细胞核发生固缩、线粒体减少，心肌间质重度纤维化。本实验证实了脓毒症时肌钙蛋白水平明显升高，说明此时心肌细胞的结构已出现明显的损伤。在脓毒症过程中，心肌细胞损伤伴随着严重的炎症反应，表现为炎症介质高迁移率族蛋白B1表达的增加，这种变化可能是心功能障碍发生的原因。

国外研究证实，高迁移率族蛋白B1在离体心肌细胞通过RAGE和TLR4介导产生显著的负性肌力作用和抑制钙电流，对离体心肌细胞产生了显著的抑制70%钙内流作用，这种作用在洗脱高迁移率族蛋白B1后部分可逆。因此，认为高迁移率族蛋白B1可能是新型的心肌抑制因子，在脓毒症心功能障碍发生发展中具有重要作用。

川芎嗪是中药川芎的有效提取物，属酰胺类生物碱，化学结构为四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TMP)。现代研究证明，川芎嗪具有抗凝、抗血小板聚集的作用，被广泛应用于心血管疾病的治疗。近年的研究还发现川芎嗪具有抗炎的作用[6]，在动物实验中初步观察到其具有保护肝、肾功能的作用。川芎嗪可明显提高脓毒症大鼠下降的LVEF值，减轻心肌损伤标记物以及炎症反应介质的表达，川芎嗪有抑制炎症反应、改善脓毒症大鼠心肌抑制的作用。其机制可能与拮抗TLR4等炎症因子介导的对心肌细胞的炎症反应以及维持细胞内游离钙稳态有关，但具体的作用机制则需进一步的研究。

参考文献：

[1]Krishnagopalan S，Kumar A，Parrillo JE，et al．Myocardial dysfunction in the patient with sepsis[J]．Curr Opin Crit Care，2002，8：376-388．

[2]Tzeng HP，Fan J，Vallejo JW，et al．Negative inotropic effects of high mobility group box 1 protein in isolated contracting cardiac myocytes[J]．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，294：H1490-1496．

[3]Rittirsch D，Huber-Lang MS，Flier MA，et al．Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture[J]．Nar Protor，2009，4 (1)：31-36．

[4]Chenq Ward MF，Sama AE，Wang H．Extracellular HMGB 1 as a proinflammatory cytokine[J]．J Interferon Cytokine Res，2004，24：329-333．

[5]Parker MM，Shelhamer JH，Bacharach SL，et al．Profound but reversible myocardial depression in patients with septic shock[J]．Ann Intern Med，1984，100： 483．

[6]吴海云，王士雯，朱姝，等．川芎嗪在急性冠状动脉综合征中抗炎作用的研究[J]．中国中西医结合急救杂志，2004，11(4)：196．

(本文编辑王雅洁)

The Protective Effect of Ligustrazine on Sepsis Myocardial Dysfunction in Septic Rats

Li Jian，Zhang Jian

Higher Education Campus Hospital，Guangdong Provintial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510000，Guangdong，China

Abstract：ObjectiveTo investigate the protective effect of ligustrazine on sepsis myocardial dysfunction in septic rats and its possible mechanism．Methods Twenty-seven rats were randomly divided into sham operated group(Sham group，n=9)，model group(CLP group，n=9)，and ligustrazine treated group(TMP group，n=9)．after 72 hours of operation，the levels of serum cardiac troponin I(cTnI)，high mobility group box-1(HMGB1)，and cardiac functions were measured at the same time points．ResultsCompared with sham group，the levels of left ventricular ejection fraction(LVEF) in CLP group decreased(P<0．05)．Compared with CLP group，the levels of LVEF in TMP group elevated(P<0．05)．The levels of cTnT and HMGB1 reduced compared with CLP group(P<0．05)．ConclusionLigustrazine can inhibit inflammatory response and improve sepsis myocardial dysfunction in sepsis rats．

Key words：sepsis；sepsis myocardial dysfunction；ligustrazine；cardiac troponinⅠ；high mobility group box-1；rat

基金项目：广东省自然基金(No．S2012010010397)

中图分类号：R285

文献标识码：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．03．011

文章编号：1672-1349(2016)03-0263-03

(收稿日期：2015-10-07)

·基础医学论著/研究·