晚期糖基化终产物对内皮祖细胞功能及成骨分化的影响

汪沁沁，岳温恒，伍　锋，贺治青，梁　春，吴宗贵

晚期糖基化终产物对内皮祖细胞功能及成骨分化的影响

汪沁沁，岳温恒，伍锋，贺治青，梁春，吴宗贵

摘要：目的观察糖尿病机体主要的晚期糖基化终产物亚型-Nε羧甲基赖氨酸修饰白蛋白(CMLs)对内皮祖细胞(EPCs)功能及成骨分化作用的影响。方法 采用密度梯度离心法从外周单个核细胞中分离、培养得到EPCs，通过观察细胞形态和流式细胞仪检测细胞表面标记鉴定。进一步采用CCK-8增殖试剂盒、Annexin V-FITC/PI流式凋亡试剂盒、transwell小室迁移实验分别观察空白对照组、BSA对照组(100 μg/mL)、不同浓度CML-BSA组(20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL)，共7组干预液对EPCs增殖、凋亡、迁移功能的影响。并检测成骨相关钙化基因BMP-2、ALP、RUNX-2和OCN的表达量，观察其对EPCs成骨分化能力的影响。结果与BSA对照组相比，CML-BSA能显著抑制EPCs增殖和迁移的能力，增加凋亡，促进其成骨分化(P<0．05)，其中80 μg/mL浓度变化最明显(P<0．05)；与BSA对照组相比，CML-BSA能显著增加成骨相关钙化基因BMP-2、ALP、RUNX-2和OCN的表达量，呈现浓度依赖性递增，80 μg/mL浓度变化最大(P<0．05)，100 μg/mL浓度呈现下降趋势(P<0．05)。结论CMLs能抑制EPCs的增殖和迁移能力，增加其凋亡，显著促进EPCs成骨分化。深入研究有助于探索糖尿病血管钙化机制，为临床干预提供新靶点。

关键词：糖尿病；内皮祖细胞；晚期糖基化终产物；成骨分化

近20年我国糖尿病患病率迅速上升，糖尿病大血管并发症已成为糖尿病病人致残和死亡的最主要原因[1]。血管钙化普遍存在于糖尿病病人，是大血管病理生理基础。目前认为血管钙化形成是一个由多种细胞启动并与骨发育相似的、主动的、高度可调控的生物学过程。血管钙化主要有两种形式，一是内膜钙化，为动脉粥样硬化的表现之一，由脂质代谢异常和炎症反应参与，并且与内皮细胞受损，内皮祖细胞(EPCs)修复障碍密切相关，多呈分散的斑片状沉积，使斑块不稳定，易导致组织缺血；另一形式是中膜钙化，主要发生于无炎性细胞浸润及脂质沉积的环境中，钙化沉积呈连续线性，弥散于整个富含弹性胶原的终末，与血管平滑肌细胞去分化密切相关[2]。糖尿病发生血管钙化的原因和机制目前尚不清楚，但钙化因子的失调起了关键性作用。

研究显示机体长期处于高血糖状态，可导致蛋白发生转录后修饰，形成Schiff碱和Amadori产物，最终形成具有高度活性的糖(AGEs)，其可与RAGEs结合，触发炎症、氧化应激反应即“AGEs- RAGEs-氧化应激轴”，导致血管内皮损伤，这被认为是糖尿病血管病变启动和进展加重最主要的“共同”分子机制[3]。AGEs是一种含有多种亚型的复合物，其中包括CMLs、CELs等，均可与其特异性受体RAGE结合，激活炎症和氧化应激，参与糖尿病血管损伤病理过程[3]。CML-BSA作为AGEs最主要的亚型，相关的研究较多，且已经商品化，故本研究选用CML-BSA作为高糖致病因素的干预剂。更为重要的是，大量研究证实，AGEs-RAGE轴参与了糖尿病血管钙化的发生发展，但其具体分子机制不清。 同时，前期研究证明，AGEs-RAGE轴可引起EPCs功能紊乱，导致糖尿病血管损伤后内源性修复障碍。这是否预示着，机体处于高糖环境中，EPCs不但不能起到内源性血管修复的作用，反而参与了血管钙化的形成，导致大血管粥样斑块病变的不稳定，引起急性心血管事件？深入的研究不但有助于揭示糖尿病血管钙化的新机制，也为今后EPCs的临床应用提供技术支持和理论依据。

1材料与方法

1．1材料CML-BSA购于美国Cell-Biolabs公司(货号 STA-314)，使用时，采用PBS稀释到所需浓度。 DMEM/ F12培养基为美国HyClone公司产品；胎牛血清(Fetal Calf Serum，FBS)为美国GIBCO公司产品。CO2细胞培养箱：美国赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，型号HERACELL 150i；流式细胞仪：美国BD公司，型号FACSCaliber；酶标仪：美国BioTek公司，型号ELx800NB；倒置显微镜：日本OLYMPUS公司，型号IX71-A12FL/PH。

1．2EPCs分离、培养及鉴定密度梯度离心法分离健康成人单个核细胞，给予含重组人血管内皮细胞生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子和10%胎牛血清的M199 培养基培养，3 d后洗去不贴壁的细胞，贴壁细胞继续给予培养基加生长因子，3 d换液一次，第8天胰酶消化收集贴壁细胞，采用激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪鉴定。

1．3分组EPCs分成对照组、BSA组、(20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL)CML-BSA组，共7组，干预24 h。

1．4检测指标及方法

1．4．1EPCs增殖能力检测96孔板每孔加入100 μL 2 000个细胞无血清培养基培养12 h同步化后，给予不同干预，每孔加入10 μLCCK-8溶液继续孵育2 h，酶标仪450 nm测定吸光度，根据实验孔与对照孔的吸光度计算分析EPCs的增殖情况。每组做5次复孔。

1．4．2EPCs迁移能力检测96孔板每孔加入100 μL 2 000个细胞无血清培养基培养12 h同步化后，给予不同干预，每孔加入10 μLCCK-8溶液继续孵育2 h，酶标仪450 nm测定吸光度，根据实验孔与对照孔的吸光度计算分析EPCs的增殖情况。

1．4．3EPCs凋亡能力检测将处理后的细胞加入195 μL Annexin V-FITC结合液(1X)重悬细胞。加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀。室温避光孵育10 min，1 000 g离心5 min，弃上清，加入190 μL Annexin V-FITC结合液(1X)轻轻重悬细胞。加入10 μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。随即进行流式细胞仪检测。每组重复5次。

1．4．4EPCs成骨分化相关骨化基因检测采用SYBR Green I嵌合荧光法在illumna公司的EcoTMReal．Time PCR仪上进行Real．Time PCR实验，所使用的试剂盒为SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus，TaKaRa code：DRR820)，反应条件为预变性95度30秒、PCR反应40个循环95度5秒60度30秒、溶解曲线采集和分析。相关成骨基因的序列详见表1。

表1　成骨相关基因引物序列

2结果

2．1EPCs培养及鉴定结果(见图 1)EPCs在培养第3天可见成集落样生长(图1A)，第8天可见细胞呈长梭形生长，细胞密集(图1B)。本课题组之前采用ac-LDL(acetylated- low density lipoprotein)和UEA-1标记EPCs；并通过流式分析细胞表型，结果显示分离的EPCs表达内皮细胞表面标记物CD34、CD31、CD105、CD73、KDR、CD146和HLA-ADC，且不表达血液中其他单个核细胞的表面标记物CD14、CD45、CD133、CD90和HLA-DR。

注：A为EPCs呈集落生长(箭头所指为细胞呈集落样生长)；

B为EPCs呈密集生长(细胞呈长梭状极性生长)

图1EPCs的分离与培养(×200)

2．2各组EPCs增殖、迁移、凋亡的比较(见表2)与BSA组比较，CML-BSA组能显著抑制EPCs的增殖、迁移，促进其凋亡，差异具有统计学意义(P<0．05)。其中80 μg/mL作用最显著。

表2　各组EPCs增殖、迁移、凋亡功能比较(±s)

2．3各组对EPCs成骨相关基因表达情况(见表3)与BSA组比较，CML-BSA组能显著增加EPCs成骨分化相关基因BMP-2、ALP、Runx-2、OCN的表达，差异具有统计学意义(P<0．05)。其中80 μg/mL作用最显著。

表3　各组对EPCs成骨基因mRNA相对表达量(±s)

3讨论

血管钙化普遍存在于糖尿病大血管病变中，易导致急性血管事件，是糖尿病病人致残和死亡的首要原因，但其机制目前尚不清楚。已知，机体持续高血糖产生的晚期糖基化终产物在血管壁的积聚以及其与晚期糖基化终产物受体相互作用所触发的氧化应激反应即“AGEs-RAGE-氧化应激轴”，是糖尿病血管病变启动和进展加重的最主要的“共同”分子机制。

本课题组前期研究发现：AGEs 可通过“AGEs-RAGE-MAPK-NF-κB”途径诱导人内皮祖细胞功能的紊乱，部分揭示了糖尿病血管病变新的致病机制[4-6]。有研究表示，动脉粥样硬化内膜钙化的病人血清中存在OCN(+)EPC，这种EPCs不但不能参与血管损伤后的修复，而且参与了微小钙化灶的形成[7]。但是AGEs-RAGE轴是否诱发EPCs成骨分化，参与糖尿病血管钙化及其调控的关键因子和相关分子机制仍不清楚。目前，糖尿病动脉粥样硬化内膜钙化具体机制不清，相关的研究多集中在BMPs家族的调控作用和钙磷代谢失衡。日本学者Yusuke Nakagawa教授提出内膜钙化主要是因为VSMCs接受炎症、氧化应激等外源性刺激后，可激活BMPs信号通路，导致血管内膜成骨前体细胞发生成骨表型转化，成骨相关基因Runx2表达增高，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)表达增高，进而导致钙磷代谢异常，形成羟磷灰石结晶，最终形成动脉粥样硬化内膜微小钙化灶[8]。这一研究结果和相关理论得到广泛认可，然而血管壁存在哪些成骨前体细胞需要进一步探索。

糖尿病病人内皮损伤后，内源性血管修复功能障碍，其相关的研究多集中于AGEs引起EPCs功能的紊乱[9]。糖尿病病人的血管，不但修复功能障碍，而且血管粥样硬化更重、钙化更重，发生急性血管事件的几率也更高。近年来的meta-analysis结果就表明，糖尿病病人血管钙化程度较对照组严重，且更易出现急性血管性事件，病人预后差[10]。糖尿病病人机体持续高血糖，易导致微血管和大血管并发症，其相关的研究多集中于炎症[11]、氧化应激[12]和免疫失调[13- 14]，然而糖尿病血管并发症病理变化的焦点是血管钙化和动脉粥样硬化，钙化相关的成骨变化从何而来？目前临床和基础研究结果分析，在系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)[15]、风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)[16]等炎症、免疫为主要病理基础的疾病合并动脉粥样硬化内膜钙化的病人体内，EPCs不但参与内源性血管修复功能异常，更重要的是成骨表型分化，参与钙化形成和发展。也有研究提出，在C57BL/6 LDLr(-/-)小鼠体内分析动脉粥样硬化内膜钙化中细胞来源，发现骨髓来源CD34+CD13+前体细胞(Myeloid CD34+CD13+precursor cells)渗入斑块，成软骨样分化后参与动脉粥样硬化内膜钙化，而骨髓来源CD34+CD13+前体细胞就是类似于EPCs的细胞群[17]。大量研究显示，EPCs可能就是我们一直寻找的最重要的成骨前体细胞，机体持续高糖环境下，不但导致EPCs无法行使血管损伤后内源性修复功能，而且导致EPCs接受成骨调节信号，发生成骨表型的转化，参与糖尿病动脉粥样硬化内膜微小钙化灶的发生和发展。在临床上，糖尿病和冠心病，一直被认为是“等危症”，这两个疾病病理病机相互交联，相互促进，以至于出现患病发病年轻化、病变严重、药物疗效差、病死率高的临床困境；在基础研究领域，糖尿病和冠心病存在相同的分子机制，尤其是血管损伤机制。在AGEs的形成过程中，可产生反应性氧的中间产物，这些中间产物可以使蛋白质、脂类等发生氧化，其中尤以脂质过氧化最为重要。这种过氧化物又能促进AGEs的形成。在脂质过氧化物中，低密度脂蛋白的糖基化和氧化又是粥样硬化的发生发展始动因素和推动因素。因此，AGEs介导的血管损伤研究，无论是糖尿病防治领域，还是冠心病防治领域，都显得尤为重要。

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(本文编辑王雅洁)

Effects of Advanced Glycation End Products on Function and Osteogenic Differentiation of Human Endothelial Progenitor Cells

Wang Qinqin，Yue Wenheng，Wu Feng，He Zhiqing，Liang Chun，Wu Zonggui

Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of Nε-(carboxymethyl) Lysine albumin(CMLs)，a primary advanced glycation end products isoform in diabetic body，on function and osteogenic differentiation of human endothelial progenitor cells(EPCs)．Methods EPCs were isolated and cultured by Ficoll density gradient centrifugation from human mononuclear cells，then were identified to observe cultured cells' morphology and detected cell surface marker by flow cytometry．The cells were exposed to 7 different interventions respectively for 24 hours，including PBS，100 μg/mL BSA，and CML-BSA (20，40，60，80，100 μg/mL)．The proliferation capability of such cells was evaluated using CCK-8 assay，migration ability was explored by transwell assay，and apoptotic rates were investigated by Annexin V-FITC/PI FCM kits．ResultsCompared with the BSA group，proliferation and migration capability of EPCs were inhibited by stimuli with CML-BSA (n=6，P<0．05)，but apoptosis of such cells were promoted，and the concentration of CML-BSA (80 μg/mL) was the most effective one．Compared with the BSA group， the expression levels of osteogenesis-related genes，like bone morphogenetic protein 2 (BMP-2)，alkaline phosphatase (ALP)，runt-related transcriptional factor 2 (RUNX-2) and osteocalcin (OCN)，were increasing gradually by CML-BSA treatment，and it shown the concentration-dependent．The concentration of CML-BSA (80 μg/mL) was the most effective one，but the effect of concentration of CML-BSA (100 μg/mL) went down．ConclusionCMLs could significantly reduce proliferation，migration，capability，but promote apoptosis and the expression levels of osteogenesis-related genes of EPCs．It could be helpful to explore the mechanism of diabetic vascular calcification，and provide new drug targets for clinical intervention．

Key words：Qiabetes；endothelial progenitor cells；advanced glycation end products；osteogenic differentiation

中图分类号：R587R255

文献标识码：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．03．012

文章编号：1672-1349(2016)03-0266-05

Corresponding Author：Wu Zonggui

(收稿日期：2015-12-17)