不同剂量中波紫外线照射对角质形成细胞的氧化损伤作用

尹颂超，张云青，薛晓杨，李 欢

（1.中山大学附属第三医院皮肤科 广东 广州 510630；2.广州市天河区冼村街社区服务中心 广东 广州 440100；3. 中山大学附属第一医院皮肤科 广东 广州 510080）



不同剂量中波紫外线照射对角质形成细胞的氧化损伤作用

尹颂超1，张云青1，薛晓杨2，李 欢3

（1.中山大学附属第三医院皮肤科 广东 广州 510630；2.广州市天河区冼村街社区服务中心 广东 广州 440100；3. 中山大学附属第一医院皮肤科 广东 广州 510080）

［摘要］目的：观察不同剂量中波紫外线（UVB）照射对角质形成细胞（HaCaT细胞）的氧化损伤作用。方法：体外培养人永生化角质形成细胞，用5mJ/cm2、10mJ/cm2、20mJ/cm2、30mJ/cm2、40mJ/cm2UVB照射，24h后检测细胞丙二醛（MDA）的含量、超氧化物歧化酶（SOD） 的活性、细胞上清乳酸脱氢酶（ LDH）的含量及角质形成细胞的增殖活性。结果：UVB照射Hacat细胞后，细胞SOD活性降低、MDA含量增加、LDH漏出量增加及细胞增殖抑制均呈剂量依赖性。当剂量达到10mJ/cm2时，首先出现LDH漏出量增加及细胞增殖活性的抑制，20mJ/cm2时Hacat细胞的SOD活性降低，30～40mJ/cm2MDA含量才开始出现明显增加。结论：30～40mJ/cm2的UVB照射角质形成细胞能诱发氧化损伤作用，为今后体外光老化研究提供参考。

［关键词］中波紫外线；角质形成细胞；氧化损伤；光老化；光损伤

日光中的紫外线是导致皮肤晒伤、光老化及皮肤癌的重要因素。中波紫外线（Ultraviolet B，UVB）的生物学效应强度是长波紫外线（Ultraviolet A，UVA）的800～1 000倍，可直接作用于DNA或诱发氧化反应产生自由基等机制作用于机体细胞，导致皮肤中自由基浓度增高，是引起皮肤光老化的主要诱发因素［1］。使用单一的UVB照射是构建光老化细胞模型的常用方法，但是目前各研究者使用剂量不同。本文采用不同剂量中波紫外线照射人皮肤角质形成细胞建立光老化模型研究其引起的氧化损伤作用，为皮肤光老化体外研究提供基础。

1　材料和方法

1.1实验细胞株

人永生化角质形成细胞Hacat细胞（武汉大学中国典型培养物保藏中心）。

1.2试剂和仪器

胎牛血清（Gibco公司）； DMEM（dulbecco's modified eagle medium）-高糖培养基（Gibco公司）；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（Amresco公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（Amresco公司）；超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）试剂盒，（南京建成公司）；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）试剂盒（南京建成公司）；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒（南京建成公司）。紫外线治疗仪（上海希格玛高技术有限公司）；紫外线强度计（深圳市欣宝瑞仪器有限公司）；高速冷冻速离心机（德国Hettich公司）；SW-CJ超净工作台（上海锦昱科学仪器有限公司）；TC2123型二氧化碳培养箱（Sheldon公司）；MK3酶标仪（Thermo Fisher公司）

2　方法

2.1HaCaT细胞培养

HaCaT 细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，置CO2培养箱（培养条件5%CO2、饱和湿度、37℃）中培养。2.2 UVB诱导细胞老化

参考相关文献建立细胞光老化模型的方法［2-3］。UVB照射前一天对细胞进行传代，使其汇合度为50%～70%。照射前将培养液吸去，PBS缓冲液冲洗一次，再加入少量PBS缓冲液覆盖照射细胞上层，以UVB光源照射，剂量为5mJ/cm2，10mJ/cm2，20mJ/cm2，30mJ/cm2，40mJ/cm2。正常组细胞不经UVB照射处理，作为对照。照射完后，吸弃PBS，加入培养液继续培养24h，获细胞培养上清或细胞，用于后续实验。

2.3MTT检测

将HaCaT细胞以4×104个/孔接种于96孔板，待细胞贴壁后，模型组及给药组按2.2方法造模，对照组按常规培养。造模后各组给予培养液100µl，培养24h后，小心吸弃培养液，再向各孔加入MTT溶液（5mg/ml）100µl，继续培养4h后，小心吸弃上清，每孔加DMSO 150µl，振摇15min，使沉淀充分溶解，酶标仪570nm测定吸光度。细胞存活率=模型组OD值/正常组OD值×100%。

2.4SOD活性及LDH、MDA含量检测

HaCaT细胞接种六孔板UVB照射处理24h后，取上清按照试剂盒说明书操作检测LDH含量。同时将细胞培养板中加入裂解液150µl每孔覆盖满细胞，裂解30min，用移液器轻轻吹打，收集细胞裂解液，按照试剂盒说明书操作检测细胞SOD活性和MDA 含量。

2.5统计学方法

使用SPSS16.0软件进行数据分析与统计，多组计量资料采用单因素方差分析方法进行检验，P＜0.05有统计学意义。

3　结果

3.1UVB照射对HaCaT细胞增殖活性的影响

不同剂量紫外线照射HaCaT细胞后，细胞增殖率减低，与正常对照组比，当UVB剂量达到10mJ/cm2时出现显著差异P＜0.05，20mJ/cm2，30mJ/cm2，40mJ/cm2有非常显著差异（P＜0.01），见表1。

表1　UVB照射对Hacat细胞增殖活性的影响　（±s，n=6）

表1　UVB照射对Hacat细胞增殖活性的影响　（±s，n=6）

注：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01

UVB剂量（mJ/cm2） 　 吸光值 　 增殖率0 　 0.545±0.02 　 100% 5 　 0.548±0.02 　 100.55% 10 　 0.412±0.01*　 75.63% 20 　 0.385±0.04**70.67% 30 　 0.305±0.01**55.99% 40 　 0.248±0.01**45.53%

3.2UVB照射对HaCaT细胞氧化损伤的作用

UVB照射HaCaT细胞，随着照射剂量的不同，细胞受到不同程度的氧化损伤作用，细胞SOD活性降低、MDA含量增加及上清中的LDH含量增加均呈剂量依赖性。当剂量达到10mJ/cm2时，首先LDH漏出量增加明显（P＜0.05），20mJ/cm2，30mJ/cm2，40mJ/cm2增加更显著（P＜0.01）。照射剂量为20mJ/cm2，30mJ/cm2，40mJ/cm2的UVB能使Hacat细胞的SOD活性降低（P＜0.01）。而当剂量达到30～40mJ/ cm2MDA含量才开始出现明显增加（P＜0.01），见表2。

表2　 UVB照射对HaCaT细胞SOD及MDA、LDH含量的影响　（±s，n=6）

表2　 UVB照射对HaCaT细胞SOD及MDA、LDH含量的影响　（±s，n=6）

与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01

UVB剂量（mJ/cm2） 　 SOD活性（U/mgprot） 　 MDA含量（nmol/mgprot） 　 LDH含量（U/L）0 　 6.15±0.77 0.58±0.05 601±65.07 5 　 6.02±0.74 0.56±0.08 700±95.10 10 　 5.83±0.46 0.61±0.06 792±80.02*20 　 4.74±0.57**0.68±0.08 1020±104.31*30 　 4.08±0.47**　 0.81±0.09**1581±96.44**40 　 3.81±0.34**0.87±0.08**1640±90.63**

4　讨论

紫外线照射人及动物的皮肤后，能够产生较多的活性氧（reactive oxygen species， ROS）［4-5］。正常情况下，细胞内存在一系列抗过氧化物酶，如超氧化物歧化酶（SOD）等，可以清除细胞内产生的ROS，活性氧与抗氧化酶之间存在一个动态平衡。当细胞内ROS生成增加、清除ROS能力下降和抗氧化能力减弱时可致细胞氧化损伤［6-7］。UVB造成的氧化性应激还可引发一系列细胞内信号传导，通过核转录因子NF-KB 或转录因子激活蛋白1（AP-1）激活下游基质金属蛋白酶（matrix Metalloprotease，MMP） 等基因的表达［8］。导致了MMP mRNA 的含量和表达增加，出现光老化的皮损［9］。本文采用不同剂量UVB照射Hacat细胞结果显示UVB照射处理Hacat细胞，随着照射剂量的不同，对细胞产生不同的影响。当照射剂量为5mJ/cm2时，UVB对细胞的影响不明显。当剂量达到10mJ/cm2时，LDH漏出量增加明显，说明细胞膜稳定性下降，受到一定程度损伤。同时MTT方法观察到细胞的增值活性受到抑制，说明UVB 可损伤线粒体膜，使琥珀酸脱氢酶活性降低，抑制成角质形成细胞的增殖［10］。当剂量达到20mJ/cm2，出现SOD活性明显下降，与细胞受到UVB照射产生过多自由基导致SOD受到消耗有关［11］。当照射剂量达到30～40mJ/cm2出现MDA含量明显增加。生物膜是氧自由基重要的靶组织，氧自由基攻击膜上磷酯中的多不饱和脂肪酸，引发膜脂质过氧化链式反应。MDA是脂质过氧化最终产物之一［8］，是评价脂质过氧化常用的指标之一［12］，表明30～40mJ/cm2的UVB对细胞产生了氧化损伤。以上结果说明UVB照射角质形成细胞在低剂量时即可产生一定程度的损伤，但是无明显氧化损伤，需要较高剂量的照射才能进一步打破细胞本身自由基产生和清除的动态平衡，导致细胞的氧化损伤。这也解释了本文结果中MDA的变化相对于SOD需要更高的照射剂量原因，与石潇报道一致［13］。

近年来很多学者致力于光老化的研究，随着环境污染的加重，照射到地球表面的UVB越来越多，加速了皮肤衰老［14］。光老化的防护更是其中的热点。目前的光老化研究中模型的构建方法缺乏统一性，不同的研究者即使对同样的研究对象采用的光损伤方法和光老化评价标准也并不完全相同。光源的选择，目前多数研究者使用单一的UVB照射［15］。国内外评价皮肤光老化的客观标准主要是检测衰老皮肤与正常皮肤中的与氧化相关物质（ 包括测定SOD、谷胱甘肽、过氧化物酶和过氧化氢酶活性，谷胱甘肽含量和MDA 水平） 是否存在差异［5，13］。本文试验结果显示30～40mJ/cm2UVB照射角质形成细胞使细胞SOD活性及MDA含量均出现明显下降，使细胞出现明显氧化损伤，进一步证实一定剂量UVB照射角质形成细胞作为光老化模型的可行性。所得出的照射剂量点可用于制备体外细胞紫外线UVB光老化模型，为研究皮肤光老化和紫外线防护药物的作用机理和生物效应提供理论依据。

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编辑/张惠娟

The oxidative damage on keratinocytes from UVB at different doses

YIN Song-chao1， ZHANG Yun- qing1， XUE Xiao-yang2， LI Huan3
（Department of Dermatology， The Third Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， Guangdong， China；2.Tianhe District Xiancun Street Community Health Service Centre， Guangzhou 440100，Guangdong，China； 3. Department of Dermatology， The First Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080，Guangdong，China）

Abstract:Objective To investigate the oxidative damage effect on keratinocytes from UVB at different doses. Methods Human keratinoctes were exposed to UVB at different doses of 5mJ/cm2，10mJ/cm2，20mJ/cm2，30 mJ/cm2，40mJ/cm2. After 24h，the content of cellular malond-ialdehyde （MDA）， the LDH in culture solution， the activity of cellular superoxide dismutase （SOD） and the cellular viability were measured. Results The decrease of SOD activity and the cellular viability， and the increase of MDA and LDH were induced by UVB in a dose-dependent manner. Irradiation of keratinocytes with UVB at 10mJ/ cm2resulted in a significant decrease of cellular viability and a significant increase of LDH in culture solution. The decrease of SOD activity and the increase of MDA were induced at 20mJ/cm2and 30～40mJ/ cm2， respectively. Conclusion The oxidative damage on keratinocytes can be induced by UVB irradiation at 30～40mJ/cm2.

Key words:Ultraviolet B； keratinocyte； oxidative damage； photoaging； photo damage

［中图分类号］R758

［文献标志码］A

［文章编号］1008-6455（2016）05-0057-03

基金项目：广东省科技计划项目（2013B021800187）

通信作者：张云青，中山大学附属第三医院皮肤科副主任医师，主要研究方向：皮肤美容治疗；地址：广东省广州市天河路600号，邮编：510630；E-mail：zyq01@163.com

［收稿日期］2016-02-26 ［修回日期］2016-04-27