提高根癌农杆菌介导黑曲霉转化效率的研究

曹张磊，王德培，张 岚

（工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457）



提高根癌农杆菌介导黑曲霉转化效率的研究

曹张磊，王德培，张 岚

（工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

摘 要：为提高根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导黑曲霉（Aspergillus niger）转化（ATMT）效率，本文对影响转化效率的分生孢子与农杆菌的比例、转化媒介、诱导溶氧、诱导时间、诱导时乙酰丁香酮（AS）浓度这5个因素进行单因素实验，最终确定提高其转化效率的最优条件为：根癌农杆菌诱导过程在400，μmol/L乙酰丁香酮终浓度条件下，100，mL三角瓶中28，℃、100，r/min振荡培养5，h，分生孢子与根癌农杆菌的比例为1∶100，在硝酸纤维膜媒介上24，℃共培养48，h.在此优化条件下，黑曲霉的转化效率达到35个/107分生孢子.相比于优化前，转化效率提升了78%，并且整合至黑曲霉基因组的外源潮霉素B抗性基因在转接15代以后仍能稳定遗传.

关键词：黑曲霉；根癌农杆菌；潮霉素B抗性

黑曲霉（Aspergillus niger）现已成为重要的工业发酵菌种之一，广泛应用于食品加工、轻化纺织、饲料加工、废物处理、医药等领域.工业生产菌株黑曲霉（Aspergillus niger）CBS 513.88全基因组测序的完成为在分子层面上研究黑曲霉代谢机理、提升菌株性能奠定了理论基础［1］.根癌农杆菌介导转化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）方法的建立，大大简化了丝状真菌的转化操作，提高了其转化效率，为丝状真菌基因功能的研究、有用基因的克隆表达与菌株遗传性能的改造开辟了一条全新途径.

根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能够侵染植物体受伤的组织细胞的革兰氏阴性菌，最初应用于植物细胞的基因转化研究，其能在自然状态下对受伤的植物细胞所释放的各种酚类物质产生趋向性，侵染植物伤口进入细胞后，将T-DNA［2］转入植物细胞内并整合至植物的基因组中，最终导致植物肿瘤的产生，广泛应用于农业生产中植物体的遗传改造.De Groot等［3］利用根癌农杆菌转化了黑曲霉，这为丝状真菌的遗传转化提供了新的研究方法.根癌农杆菌介导黑曲霉转化效率受到诸多因素的影响，如何提高其在黑曲霉中的转化效率仍是一个值得研究的课题.黎明等［4］发现孢子悬液的新鲜程度和浓度、农杆菌菌液浓度、共培养时间、共培养温度这5个主要因素对农杆菌介导黑曲霉的转化效率产生较大影响.郭慧等［5］发现乙酰丁香酮加入与否对日本曲霉转化效率有着明显的影响，进一步验证了诱导物的添加能活化农杆菌中的毒性蛋白，提高侵染效率.龙朝钦等［6］对根癌农杆菌介导的烟曲霉转化条件进行优化时发现，转化媒介对根癌农杆菌介导烟曲霉转化效率影响显著.本文曾参考黎明等［4］和Michielse等［7］的实验方法所得到的转化子平均个数为15个/107分生孢子，转化效率低，推测其原因是农杆菌的侵染毒性低.通过查阅文献，发现很少有学者关注诱导农杆菌过程各因素对转化效率的影响，因此本文就提高农杆菌侵染毒性即农杆菌在诱导过程中溶氧条件、诱导时间、诱导物乙酰丁香酮浓度以及其他相关提高转化效率的因素进行了研究，为进一步完善根癌农杆菌介导的黑曲霉遗传转化体系奠定基础.

1　材料与方法

1.1菌株、质粒与培养基

黑曲霉（Aspergillus niger）CGMCC 5751、根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）AGL1、质粒p50均为本实验室保存.

LB培养基：蛋白胨10，g，酵母粉5，g，氯化钠10，g，蒸馏水定容至1，L，固体培养基中加入琼脂粉15，g，121，℃灭菌20，min.

PDA固体培养基：称取去皮马铃薯200，g，切成小块，加入适量蒸馏水，煮沸30，min，6层纱布过滤，定容至1，L，加入葡萄糖20，g，琼脂粉20，g，121，℃灭菌20，min.

IM诱导培养基、CM培养基、农杆菌侵染所需培养基及试剂参考文献［7］配制.

1.2试剂与溶液的配制

Taq DNA聚合酶、T4，DNA连接酶、限制性内切酶等，TaKaRa公司；乙酰丁香酮（AS），Sigma公司；质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、潮霉素B，Solarbio公司；2-（N-吗啉代）乙烷磺酸钠盐（MES），上海生工生物工程有限公司；其他试剂，天津市北方天医化学试剂厂.

基因组提取缓冲液：5，mol/L NaCl 20，mL，0.5，mol/L EDTA 100，mL，1，mol/L Tris-HCl（pH 8.5）50，mL，10%， SDS 100，mL，蒸馏水定容至1，L.

TE缓冲液：1，mol/L Tris-HCl（pH 8.0）10，mL，0.25，mol/L EDTA（pH 8.0）4，mL，蒸馏水定容至1，L.

pH 5.0，HAc-NaAc溶液：称取NaAc 5.4，g，溶于适量去离子水中，用醋酸调节pH至5.0，定容至100，mL.

苯酚混合物：苯酚、三氯甲烷、异戊醇按体积比24∶25∶1量取混合.

1.3黑曲霉分生孢子的制备

取6，mL灭菌蒸馏水，从培养4，d的黑曲霉PDA平板上洗孢子，用无菌水稀释孢子悬液，血球计数板计数至孢子密度为2×107，mL-1备用.

1.4根癌农杆菌AGL1感受态细胞的制备

挑取根癌农杆菌AGL1接种于3，mL LB液体培养基中，28，℃、180，r/min培养过夜；取2，mL培养液于100，mL LB液体培养基中继续培养，至A600为0.5左右；将培养液置冰浴中40，min，4，℃、5，000，r/min离心10，min，弃去上清液；4，℃、10，mL的无菌水离心洗涤1次，弃去上清液；用4，℃、10，mL 10%，甘油悬浮菌体；4，℃、5，000，r/min离心5，min，弃去上清液；用1，mL预冷的10%，甘油悬浮，分装成每管70，μL，-70，℃保存.

1.5根癌农杆菌的转化与培养

取1，μL具有潮霉素B抗性基因的重组质粒p50质粒，加到70，μL根癌农杆菌AGL1感受态细胞中，混匀，吸取并加到间距0.2，cm电转杯中，擦拭干净，调节电击电压2.5，kV，电击5，ms.将电转化［8］后的根癌农杆菌涂布于LB（含100，μg/mL卡那霉素）平板上进行筛选，筛选得到的阳性克隆子在LB（含100，μg/mL卡那霉素）平板上划线，28，℃培养2，d，挑取单菌落接种于5，mL（含100，μg/mL卡那霉素）的LB液体培养基中，28，℃、180，r/min培养16～20，h，将1，mL根癌农杆菌菌液接种于含有相应抗性的100，mL LB液体培养基中，按照同等条件继续培养至A600为0.8备用.

1.6优化转化条件

将4，mL（A600=0.8）根癌农杆菌菌液5，000，r/min离心5，min收集菌体，用6，mL含有不同浓度AS（200、400、600、800，μmol/L）的IM诱导培养基悬浮菌体，在不同溶氧条件下（直径18，mm试管、25，mL三角瓶、100，mL三角瓶）进行不同时间段（2、4、5、6、8，h）诱导培养，取黑曲霉孢子悬液250，μL，调节诱导后根癌农杆菌菌液浓度，按黑曲霉孢子与农杆菌不同比例（1∶1、1∶10、1∶100、1∶1，000）等体积混合均匀，涂布在不同的转化媒介（尼龙膜、硝酸纤维膜、醋酸纤维膜、醋酸硝酸混合膜）的IM固体培养基上，24，℃避光培养48，h，然后将混合体系用无菌水稀释后涂到含有150，μg/mL潮霉素B平板上进行初筛，培养4～5，d，随后转接至200，μg/mL潮霉素B进行复筛，每种条件重复3次，验证转化子后记录转化子个数.以107个分生孢子所得到的具有潮霉素B外源基因的转化子个数来表示转化效率.具体操作详见文献［7］.

1.7转化子验证及遗传稳定性的验证

提取黑曲霉转化子基因组，以潮霉素B抗性基因序列设计引物（见表1），PCR方法验证.

表1　潮霉素B引物Tab.1　Primers of hygromycin B

从筛选培养基中随机选取转化子在CM培养基中培养传代，转接15代以后，提基因组对潮霉素B进行PCR验证，确定抗性基因的稳定性.

1.8统计学方法

用Mintab 16统计软件进行单因素方差分析.

2　结果与讨论

2.1黑曲霉对潮霉素B的敏感性

根癌农杆菌介导的丝状真菌转化体系的构建可以使用多种形式的受体细胞，如原生质体、分生孢子、菌丝体等［3］，本实验采用了较易制备的分生孢子作为受体.所以用黑曲霉孢子对潮霉素B进行敏感性实验.

将黑曲霉孢子悬液涂布于含有不同浓度潮霉素B的CM培养基中培养，观察菌体生长情况，结果见表2.随着潮霉素B质量浓度增大，黑曲霉的生长逐渐受到抑制，当质量浓度达到150，μg/mL时，黑曲霉已经无法生长.本实验选择150，μg/mL潮霉素B为初筛质量浓度，200，μg/mL潮霉素B为复筛质量浓度.

表2　黑曲霉CGMCC 5751对潮霉素B的敏感性Tab.2　Sensitivity of A. niger CGMCC 5751 to hygromycin B

2.2黑曲霉分生孢子与根癌农杆菌的比例对转化效率的影响

在其他条件一样的情况下，取2×107，mL-1黑曲霉孢子悬液250，μL与不同浓度根癌农杆菌250，μL混合，最终按体积比为1∶1、1∶10、1∶100、1∶1，000充分混匀，涂布在IM固体平板上，24，℃避光培养48，h，然后转移到CM筛选平板（含150，μg/mL潮霉素B）上筛选转化子，实验结果如图1所示.在一定范围内（1∶1～1∶100），黑曲霉分生孢子与根癌农杆菌的比例增加时，转化子的数量随之提高，但是当达到1∶1，000时，转化子的数量反而降低.单因素方差分析显示比例为1∶100时转化效率最佳，与其他各组的差异具有统计学意义（P＜0.01）.然而提高至1∶1，000时转化子反而减少，分析原因是根癌农杆菌浓度过高，与黑曲霉共同竞争培养基中的营养物质，同时也使其转接至选择培养基上后不易被清除，影响转化子的生长［9］.

图1　黑曲霉分生孢子与根癌农杆菌的体积比对转化效率的影响Fig.1　Effect of A. niger conidia to A. tumefaciens ratio on transformation efficiency

2.3诱导培养基中加入AS浓度对转化效率的影响

将4，mL（A600=0.8）根癌农杆菌菌液5，000，r/min离心5，min，收集菌体，用6，mL含有不同浓度的AS（200、400、600、800，μmol/L）的IM诱导培养基悬浮菌体，在相同的实验条件下进行介导转化，结果如图2所示.AS浓度为400，μmol/L时，转化效率最高，与其他各组的差异具有统计学意义（P＜0.01）.

不同AS浓度对根癌农杆菌诱导影响较大，过高或过低的AS浓度都不利于转化的进行，实验设立4个不同的浓度梯度对其进行研究，发现当AS诱导浓度为400，μmol/L时，根癌农杆菌对黑曲霉的转化效率最高.ATMT是通过根癌农杆菌中Ti质粒内毒力区编码的各种蛋白共同作用来实现的，而AS对根癌农杆菌中的毒性基因起到诱导或辅诱导作用［10］，激活毒力区基因的表达.在一定浓度范围内，随着AS浓度的增加转化效率也随之提升，这与De Groot等［3］的研究结果一致.但当AS浓度超过400，μmol/L后，随着AS浓度的增加转化效率反而下降，其原因可能是AS过量会抑制毒蛋白的活性，降低其侵染效率，同时过高的AS浓度对黑曲霉生长产生一定的抑制，导致转化子数量减少.

图2　 诱导培养基中加入AS的浓度对转化效率的影响Fig.2　Effect of concentration of AS in inducing medium on transformation efficiency

2.4诱导根癌农杆菌时溶氧对其转化效率的影响

将4，mL（A600=0.8）根癌农杆菌菌液5，000，r/min离心5，min，收集菌体，用6，mL含有400，μmol/L AS 的IM诱导培养基悬浮菌体，分别于直径18，mm试管、25，mL三角瓶、100，mL三角瓶中诱导培养至A600=0.8，在相同的实验条件下进行介导转化，结果如图3所示.随着诱导培养时溶氧的增大，转化效率也随之上升，差异具有统计学意义（P=0.001）.

图3　 诱导溶氧对转化效率的影响Fig.3　Effect of inducing dissolved oxygen on transformation efficiency

根癌农杆菌诱导培养时溶氧的高低对转化效率也产生一定的影响.随着溶氧的增加，根癌农杆菌代谢旺盛，细胞增殖，活力增强，其所分泌的毒蛋白活性也相应增强［11］，使T-DNA更容易侵入进宿主细胞内，转化效率也相应提高.

2.5诱导时间对转化效率的影响

将4，mL（A600=0.8）根癌农杆菌菌液5，000，r/min离心5，min，收集菌体，用6，mL含有400，μmol/L AS 的IM诱导培养基悬浮菌体，将根癌农杆菌菌液分别诱导培养2～8，h，培养后将根癌农杆菌菌体浓度调成一致，在相同的实验条件下进行介导转化，结果如图4所示.随着诱导时间的延长，转化效率也相应增大，诱导时间为5，h效果最好，低于此时间，转化效率明显下降，高于此时间效率有所下降，并且各组数据间差异具有统计学意义（P＜0.01）.这说明诱导时间过短或过长都不利于转化介导.其原因是过长的诱导时间会导致毒蛋白活性下降，同时也会导致大量假阳性转化子的产生，而过短的诱导时间又无法激活毒力区基因的表达，影响转化效率.

图4　 诱导时间对转化效率的影响Fig.4　Effect of inducing time on transformation efficiency

2.6转化媒介对转化效率的影响

取2×107，mL-1黑曲霉孢子悬液250，μL，与等体积的诱导后根癌农杆菌菌液（A600=0.8）混匀，二者比例为1∶100分别涂在贴有尼龙膜、硝酸纤维膜、醋酸纤维膜、醋酸硝酸混合膜的IM固体诱导培养基上，24，℃避光培养48，h，然后转移到CM（150，μg/mL潮霉素B）筛选平板上筛选转化子，结果如图5所示.硝酸纤维膜转化效果要明显优于其他媒介，尼龙膜效果最差，组间具有明显差异（P＜0.01）.

能够作为共培养媒介的物质有很多，如尼龙膜、硝酸纤维膜、玻璃纸等都曾被报道应用于丝状真菌的转化［12-15］，其原理是媒介能将菌体与培养基分离，但不影响菌体对培养基中营养物的吸收及其自身生长.本研究结果表明，用硝酸纤维膜进行根癌农杆菌介导黑曲霉要明显优于其他转化媒介，其原因可能是不同的膜具有不同的化学特性与吸附能力，其会影响农杆菌细胞与黑曲霉孢子的相互作用，从而导致转化效率的不同.硝酸纤维膜转化效果最优可能是由于其对毒性蛋白质具有高度的亲和性［16］.

图5　 转化媒介对转化效率的影响Fig.5　Effect of transformation media on transformation efficiency

2.7转化子的验证及遗传稳定性鉴定

随机挑取10个转化子，提取基因组进行PCR验证，10个转化子均能扩增出潮霉素B的片段.将这10个转化子培养15代后提取基因组进行PCR验证，均能扩增出潮霉素B的片段，结果如图6所示，转化子的潮霉素基因可以稳定遗传.

图6　 黑曲霉CGMCC 5751转化子PCR结果Fig.6　PCR results of the A. niger CGMCC 5751 transformants

2.8根癌农杆菌介导条件优化前后转化效率对比

将各单因素实验的最优条件综合后对黑曲霉进行介导转化实验，并与优化前的实验方法［4］进行对比，结果见表3.107分生孢子中转化子个数从平均8个上升至35个，并且在筛选平板上转化子生长明显加快（P＜0.01），转化效率明显提高.

表3　优化根癌农杆菌介导转化条件前后转化效率的对比Tab.3　Comparison of transformation efficiency before and after the optimization of A. tumefaciens-mediated transformation conditions

3　结 论

本文利用根癌农杆菌AGL1介导侵染黑曲霉，优化其转化条件，尤其是在诱导根癌农杆菌过程中各因素优化成功，进一步验证了根癌农杆菌转化体系对丝状真菌的可行性.通过本实验得出添加400，μmol/L乙酰丁香酮，100，mL摇瓶诱导根癌农杆菌AGL1培养5，h，调节黑曲霉孢子与根癌农杆菌体积比为1∶100，用共培养媒介硝酸纤维膜，根癌农杆菌AGL1介导侵染黑曲霉效果最好，107个分生孢子中黑曲霉转化子可达35个，相比于优化前的转化方法，转化效率提高了78%，.农杆菌介导丝状真菌转化体系的确立，克服了原有丝状真菌转化体系操作繁杂、转化效率低、耗时多等缺点.通过研究影响根癌农杆菌介导黑曲霉转化条件的优化，基本上确立了该方法在黑曲霉遗传转化上的一些特性，虽然对于不同的曲霉，其最优的转化条件存在着一定的差异，但对于丝状真菌遗传转化系统的建立具有重要的参考价值.

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责任编辑：郎婧

Improvement of Transformation Efficiency of Aspergillus niger Mediated by Agrobacterium tumefaciens

CAO Zhanglei，WANG Depei，ZHANG Lan

（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

Abstract：To improve the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation（ATMT）efficiency of Aspergillus niger，we performed some single-factor tests for five factors：ratio of conidia to bacterium，transformation media，inducing dissolved oxygen，inducing time and inducing concentration of acetosyringone（AS）.The optimum conditions to improve the transformation efficiency were as follows：A tumefaciens was cultivated in 400，μmol/L AS at 28，℃ and 100，r/min for 5，h in 100，mL conical flask；co-cultivation was conducted at a 1∶100，ratio of conidia to bacterium on nitrocellulose membrane at 24，℃ for 48，h.Under the above optimized conditions，the transformation efficiency of A.niger achieved 35，transformants/ 107，conidia. The transformation efficiency was increased by 78%， compared with that before optimization，and all the selected hygromycin B resistant transformants were genetically stable after 15 subcultures on complete medium.

Key words：Aspergillus niger；Agrobacterium tumefaciens；hygromycin B resistance

中图分类号：Q933

文献标志码：A

文章编号：1672-6510（2016）02-0020-06

收稿日期：2015-04-27；修回日期：2015-08-04

基金项目：国家自然科学基金资助项目（31471725）

作者简介：曹张磊（1990—），男，浙江人，硕士研究生；通信作者：王德培，教授，shiyao218@163.com.

DOI:10.13364/j.issn.1672-6510.20150054