肝X受体在百草枯致急性肺损伤小鼠肺组织中的表达及作用

胡　晓，赵宏宇，沈海涛，王　煜，郭　峰，赵　敏

肝X受体在百草枯致急性肺损伤小鼠肺组织中的表达及作用

胡晓，赵宏宇，沈海涛，王煜，郭峰，赵敏*

中国医科大学附属盛京医院急诊科，沈阳 110004

[摘要]目的研究肝X受体(Liver X receptors,LXRs)在百草枯(Paraquat,PQ)致急性肺损伤小鼠肺组织中的表达情况及保护作用。方法48只雄性c57小鼠随机分为6组,对照组：0.1 mL生理盐水腹腔注射；A组(TO901317低剂量对照组)：5 mg/kg TO901317腹腔注射；B组(TO901317高剂量对照组)：20 mg/kg TO901317腹腔注射；C组(百草枯染毒组)：百草枯28 mg/kg腹腔注射；D组(TO901317低剂量预处理组)：百草枯染毒前0.5 h 给予TO901317 5 mg/kg腹腔注射；E组(TO901317高剂量预处理组)：百草枯染毒前0.5 h给予TO901317 20 mg/kg腹腔注射。在百草枯染毒后72 h处死小鼠，收集肺组织及肺泡灌洗液标本。肺组织取出后测定肺湿重/干重比，肺组织切片后HE 染色进行肺损伤评分，采用ELISA方法检测肺泡灌洗液中IL-1β和TNF-α含量，Western blot 方法检测肺组织中LXRs(LXRα和 LXRβ)及Toll样受体4(TLR-4)的表达。结果对照组小鼠肺组织中可检测到较高水平的LXRα和 LXRβ表达，与对照组相比，百草枯中毒组小鼠LXRα和 LXRβ表达明显减少，肺湿重/干重比及肺损伤评分显著增加，肺泡灌洗液中IL-1β和TNF-α含量明显增高，TLR-4表达明显增加。上述改变在TO901317预处理组明显减轻，减轻程度与TO901317剂量有关。结论肝X受体可以在正常小鼠肺组织的中表达，百草枯中毒可显著抑制肝X受体在小鼠肺组织中表达，应用LXRs激动剂TO901317能明显减轻百草枯导致的小鼠急性肺损伤程度，这一作用可能与LXRs抑制TLR-4在肺组织中的表达有关。

[关键词]百草枯；急性肺损伤；肝X受体；Toll样受体4

0引言

百草枯(Paraquat，PQ)又名克芜踪，是一种广谱、触杀型有机杂环类除草剂。因无特效解毒药和有效的治疗手段，是目前国内中毒病死率最高的农药[1]。百草枯主要蓄积于肺组织并可在中毒早期引起急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征[2-4]。肝X受体(Liver X receptors,LXRs)是孤核受体家族的重要成员,调节胆固醇的输出、胆汁酸的生成及脂质转运蛋白的合成,从而调控脂质的动态平衡[5]。研究表明,LXRs在肺泡巨噬细胞、肺泡上皮细胞以及肺组织中有一定的表达,在肺组织的LXRs能通过各种途径减轻急性肺损伤[6]。本研究采用LXRs激动剂TO901317对小鼠进行预处理，观察百草枯中毒后急性肺损伤的改善情况，并进一步研究其可能的作用机制。

1材料与方法

1.1主要试剂、仪器和动物百草枯(Sigma，美国)；TO901317(Abcam，英国)。IL-1β和TNF-α ELISA 试剂盒(南京建成，中国)；LXRα和LXRβ抗体(Abcam，英国)；TLR-4抗体(CST，美国)；石蜡切片机和包埋机(Leitz，德国);电泳仪、半干转印仪(DYY-7C，北京六一);凝胶成像系统(WD-9413B型，北京六一)；显微镜(DP73，OLYMPUS)。雄性c57小鼠，体重18～22 g，由中国医科大学实验动物中心提供。

1.2动物分组48只雄性c57小鼠随机分为6组,每组8只。具体如下：control组(对照组)：0.1 mL生理盐水腹腔注射；A组(TO901317低剂量对照组)：5 mg/kg TO901317腹腔注射；B组(TO901317高剂量对照组)：20 mg/kg TO901317腹腔注射；C组(百草枯染毒组)：百草枯28 mg/kg腹腔注射；D组(TO901317低剂量预处理组)：百草枯染毒前0.5 h，给予TO901317 5 mg/kg腹腔注射；E组(TO901317高剂量预处理组)：百草枯染毒前0.5 h，给予TO901317 20 mg/kg腹腔注射。

1.3肺组织标本采集及肺湿重/干重比测定腹腔注射百草枯或生理盐水后72 h处死小鼠，分离肺组织。取右肺中叶，称湿重，置入80 ℃烘箱内烘48 h后称量肺的干重，计算肺组织湿/干重比值。生理盐水清洗后，将右肺其余肺叶液氮速冻后，置于-80 ℃冰箱保存用以备检测。

1.4肺泡灌洗液采集及IL-1β和TNF-α测定腹腔注射百草枯或生理盐水后72 h处死小鼠，开胸后结扎气管远端及右侧主支气管近端，在气管结扎下端处用1 mL注射器对左肺肺泡进行灌洗，取0.8 mL PBS冲洗左肺3次，每次重复3遍，回收的支气管肺泡灌洗液，于4 ℃，3 000 r/min离心10 min后取上清液，置于-80 ℃冰箱保存备用。之后严格按照ELISA试剂盒说明书步骤检测肺泡灌洗液中IL-1β和TNF-α的含量。

1.5肺组织病理形态观察取小鼠右肺上叶后，于4%多聚甲醛中固定72 h，给予脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋并制备石蜡切片，HE染色后，在光镜下(200倍)观察肺组织病理学改变，并按Mikawa等[8]方法进行肺损伤评分。评分标准:①肺泡充血，②出血，③肺泡腔或血管壁中性粒细胞浸润或聚集，④肺泡壁增厚和(或)透明膜形成4项指标分别依病变轻重评0～4分。无病变或非常轻微为0分，轻度病变为1分，中度病变为2分，重度病变为3分，极重度病变为4分。各项评定分数相加为肺损伤总评分。

1.6Western blot法检测肺组织LXRα、LXRβ、TLR-4表达水平根据每个样本的质量及体积，加入相应体积的RIPA裂解样本，然后继续置于冰上静置5 min。开启低温冷冻离心机，12 000 r/min，4 ℃，离心10 min，分离上清为所得的蛋白质抽提物。进行蛋白定量后，加样品缓冲液煮沸5 min，各取20 μL 加样;使用10%聚丙烯酰胺凝胶在150 V、30 mA 条件下电泳1.5 h;50 V条件下PVDF 膜转膜2 h;5%脱脂牛奶封闭，滴加LXRα(1∶1 000)、LXRβ(1∶1 000)、TLR-4 (1∶500)一抗孵育过夜，再次振洗后加入羊抗兔IgG-HRP(二抗) 37 ℃孵育45 min。用0.1%TBST 冲洗3 次，ECL 发光检测，X 线片显影，扫描图像，测得各条带的灰度值，以β-actin 为内参标准后，比较其表达量的变化。

2结果

2.1LXRs在小鼠肺组织的表达在对照组小鼠肺组织中可检测到较高水平LXRα和LXRβ的表达。与对照组比较，百草枯染毒组小鼠肺组织内LXRα和LXRβ的表达明显减少(P<0.05)。TO901317预处理可显著削弱百草枯染毒对LXRα和LXRβ表达的影响，使LXRα和LXRβ表达明显增加(P<0.05)。见图1。

2.2肺湿重/干重比与对照组相比，百草枯染毒组肺湿重/干重比显著增加(P<0.05)。与百草枯染毒组相比，TO901317预处理组肺湿重/干重比显著下降，高剂量组下降较明显(P<0.05)。见图2。

图1　小鼠肺组织LXRα和LXRβ的表达

图2　小鼠肺湿重/干重比

2.3肺组织病理学观察百草枯染毒后72 h，肺组织可见肺泡腔内充血，大量的中性粒细胞浸润或聚集并伴有透明膜形成，肺泡壁显著增厚及结构破坏。与百草枯染毒组相比，TO901317预处理组肺组织破坏程度明显减轻，肺损伤评分明显下降，高剂量组肺组织损伤减轻更明显(P<0.05)。见图3。

图3　小鼠肺损伤评分

2.4肺泡灌洗液IL-1β和TNF-α测定与对照组相比，百草枯染毒组肺泡灌洗液内IL-1β和TNF-α含量明显增加(P<0.05)。与百草枯染毒组比较，TO901317预处理组肺泡灌洗液内IL-1β和TNF-α含量显著下降，高剂量组下降更明显(P<0.05)。见图4。

图4　肺泡灌洗液中IL-1β和TNF-α测定

2.5TLR-4在肺组织的表达与对照组相比，百草枯染毒组TLR-4表达显著增加(P<0.05)。与百草枯染毒组比较，TO901317预处理组TLR-4表达明显下降，高剂量组下降更明显(P<0.05)。见图5。

3讨论

PQ的肺毒性可能是由于其选择性在肺内大量聚积造成的,早期表现为急性肺泡炎,以后表现为进行性加重的肺间质纤维化，但PQ引起肺损伤及后期肺纤维化的病理生理机制仍未完全明确[7]。PQ中毒早期主要表现为急性肺泡炎性改变,有多种促炎基因及细胞因子参与其中，包括TNF-α、IL-1β及 γ干扰素(IFN-γ)、磷脂酶A2(PLA2)、血小板活化因子(PAF)等，这些细胞因子对微血管内皮细胞上黏附分子的上调作用启动炎症反应及中性粒细胞在肺间质的募集和浸润，增加血管漏出，引起肺损伤；同时这些细胞因子又可刺激内皮素的合成与释放，以上环节相互诱导，形成恶性循环，加重肺损伤。因此，削弱炎症反应是减轻PQ致急性肺损伤的有效途径之一。

图5　小鼠肺组织TLR-4表达

LXRs属核受体超家族的配体激活的转录因子，其成员有LXRα和LXRβ。LXRα主要在肝、肾、脾、肠等组织以及巨噬细胞上表达，而LXRβ在几乎所有组织细胞中表达。LXRs与视黄醛核受体以杂聚二聚体形式存在，胆固醇的一些代谢产物是其内源的激活配体，如羟基固醇24(S)，25-环氧胆固醇、24(S)-羟基胆固醇和22(R)-羟基胆固醇，人工合成的GW3965、TO901317 是其特异的激活剂[8-9]。LXRα和LXRβ在肺组织、肺泡巨噬细胞和肺泡表面细胞都有一定的表达[10]，大量实验证实，LXRs的激活能有效保护肺组织，削弱由脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱发的肺组织炎症反应，从而减轻急性肺损伤[10-11]。这一作用可能与LXRs能有效地减弱TLR4信号转导途径诱发炎症因子的产生有关[12]。

TLR-4信号转导通路是目前发现的重要的炎性通路之一,多项实验证实，TLR-4信号转导通路参与PQ引起的组织损伤[13-14]。当TLR-4 与相应配体结合后,进一步激活核因子κB(NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信号通路,从而促进各种炎性细胞因子基因表达的激活。本实验证实，LXRα和LXRβ在小鼠肺组织中均可表达，小鼠百草枯染毒后，LXRα和LXRβ表达明显下降，肺组织TLR-4表达明显增加，BALF中促炎因子TNF-α及IL-1β含量显著增加，肺组织损伤明显。与百草枯染毒组比较，小鼠预防性使用LXR激动剂TO901317后，肺组织TLR-4表达显著下降，BALF中促炎因子TNF-α及IL-1β含量明显减少，肺组织损伤减轻，且这一效应与TO901317使用剂量相关。

综上所述，LXRs激活对百草枯致小鼠急性肺损伤具有保护作用，其机制可能与LXRs激活后抑制TLR-4表达，从而抑制肺部炎症反应有关。

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Expression and role of LXRs in the lung tissues of mice with paraquat-induced acute lung injury

HU Xiao，ZHAO Hong-yu，SHEN Hai-tao，WANG Yu，GUO Feng，ZHAO Min*

(Emergency Department,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the expression and role of LXRs in the lung tissues of mice with paraquat-induced acute lung injury.MethodsTotally 48 male c57 mice were randomly divided into six groups.Control group：0.1 mL normal saline solution was administered intraperitoneally.Group A(low dose TO901317 group):TO901317 was administered intraperitoneally at a dose of 5 mg/kg.Group B(high dose TO901317 group):TO901317 was administered intraperitoneally at a dose of 20 mg/kg.Group C(paraquat poisoning):paraquat was administered intraperitoneally at a dose of 28 mg/kg.Group D(low dose TO901317 pretreatment group):TO901317 was administered intraperitoneally at a dose of 5 mg/kg at 30 min before PQ administration.Group E(high dose TO901317 pretreatment group):TO901317 was administered intraperitoneally at a dose of 20 mg/kg at 30 min before PQ administration.The mice were sacrificed at 72 h after PQ administration and lung tissues and bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were collected. The lung W/D ratios were evaluated at 72 h after PQ administration,histopathological changes in the lung tissues were determined by HE staining and lung injury scores,IL-1β and TNF-α levels in BALF were measured via ELISA assay kits;the expressions of LXRs and TLR-4 were measured by Western blot.ResultsHigh levels of expression of LXRα and LXRβ were detected in the lung tissues of control group. Compared with control group,the expression of LXRα and LXRβ was significantly reduced,the lung W/D ratios,lung injury scores,IL-1β and TNF-α levels in BALF,and the expression of TLR-4 were significantly increased in PQ poisoning group.All these changes were attenuated dose-dependently in TO901317 pretreatment group.ConclusionLXRs can be expressed in the lung tissues of normal mice and PQ administration significantly reduces the expression of LXRs.TO901317( LXRs agonist) pretreatment markedly attenuates PQ-induced acute lung injury of mice.This effect may be associated with the inhibition of TLR-4 expression in the lung tissues by LXRs.

Key words：Paraquat;Acute lung injury;Liver X receptors;TLR-4

收稿日期：2016-02-16

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201605003