染色体9p21区域rs10757274多态性与缺血性脑卒中相关性的Meta分析*

刘伟　熊利　柳华　季一飞　龙继发　何学芳　罗晓寒

(1. 川北医学院第二临床医学院·南充市中心医院神经内科， 四川 南充 637000；>2.罗江县人民医院内科， 四川 罗江 618500)

·论著·

染色体9p21区域rs10757274多态性与缺血性脑卒中相关性的Meta分析*

刘伟1,2熊利1柳华1季一飞1龙继发1何学芳1罗晓寒2

(1. 川北医学院第二临床医学院·南充市中心医院神经内科， 四川 南充 637000；>2.罗江县人民医院内科， 四川 罗江 618500)

【摘要】目的应用Meta分析方法探讨染色体9p21单核苷酸多态性(SNP)位点rs10757274与缺血性脑卒中(IS)易感性的关系。方法广泛检索中英文数据库中的相关研究，对符合纳入标准的每个研究采用纽卡斯尔-渥太华量表(NOS)进行质量评估。运用随机或固定效应模型计算比值比(OR)，使用Q统计量检验法及I2统计量检测各研究之间的异质性，漏斗图和Egger检验评估发表偏倚。结果共纳入9篇文献10个研究，累计病例6746例，对照12577例。Meta分析结果显示， rs10757274基因多态性G等位基因增加IS的发病风险(OR=1.11, 95%CI: 1.06～1.16, P<0.001)；G等位基因或GG基因型增加了亚洲人大动脉粥样硬化脑梗死(LAS)的发病风险(等位基因模型：OR=1.18, 95%CI: 1.06～1.31, P=0.002；隐性模型：OR=1.33, 95%CI: 1.12～1.57, P=0.001)。未见发表偏倚。结论染色体9p21区域SNP rs10757274基因多态性与IS易感性相关。但该结论仍需大样本研究进一步验证。

【关键词】9p21；单核苷酸多态性；rs10757274；缺血性脑卒中；Meta分析

脑卒中是世界上第二位最常见的死亡原因和主要的致残原因[1]。2008年全国第三次居民死因调查发现，脑血管病已跃居为我国城乡居民第1位死因[2]。缺血性脑卒中(IS)占全部脑卒中的80%左右，严重威胁着人们的身心健康。研究发现，IS是由遗传因素和环境因素相互作用或分别作用于不同环节而引起的一种复杂疾病[3]，然而确切的遗传学原因仍未知。因此，积极寻找IS发生的遗传易感基因，对有效防治IS意义重大。

既往研究发现，染色体9p21区域与动脉粥样硬化疾病密切相关，如冠状动脉疾病(CAD)和IS[4,5]。然而系列9p21区域与IS的关联研究结论却不一致。既往有研究者运用Meta分析方法研究9p21与IS相关性，但存在纳入研究不全面或不准确、数据提取有误等问题，并且近年来新的研究不断出现。因此，我们选择经全基因组关联研究(GWAS)证实的9p21上阳性位点rs10757274作为代表[6]，运用Meta分析方法，全面评估该位点与IS相关性。

1材料和方法

1.1合格研究的纳入以“9p21”、“CDKN2A/B”、“ANRIL”、“多态性”、“变异”、“中风”、“卒中”、“缺血性脑卒中”、“脑梗死”、“脑梗塞”、“脑血管病”不同组合作为关键词，全面检索PubMed(1966～2015.11)、荷兰医学文摘数据库(EMBASE，1966～2015.11)、循证医学数据库(the Cochrane Library，2015年11期)、BIOSIS Preview数据库(1990～2015.11)、心理学文献资料库(PsycINFO，1967～2015.11)、中国生物医学数据库(CBMdisc，1979～2015.11)等中英文数据库，凡是涉及rs10757274基因多态性与卒中关系的研究都被仔细评估。

相关研究的参考文献、综述文章、有关会议的摘要都被检索以发现可能的合格研究。若有重复发表，只纳入最近期或最完整的研究。对照人群来源不受限制，对照组人群基因型分布不符合Hardy-Weinberg平衡律(HWE)的研究被排除[7]。

符合下列标准的研究被纳入Meta分析：①基于人群的病例对照研究，巢式病例对照或队列研究，探讨rs10757274基因多态性和IS相互关系。②IS的诊断采用已被各国广泛接受的诊断标准。③对照组是无关个体，经检查确认无任何血管疾病。④对照组和病例组都详细描述了等位基因和基因型频率分布；或者提供的数据可以计算比值比(OR)及95%可信区间(95%CI)。⑤对照组人群基因型分布符合HWE[8]。

1.2数据提取对合格研究提取以下信息：① 文献作者、研究对象国家和种族背景、发表年代和杂志名称。② 纳入研究总的例数, 病例组和对照组研究对象的定义和特点。③ 病例组和对照组的等位基因和基因型的分布情况。④ 基因分析样本来源和采用的方法、IS亚型以及基因-基因和基因-环境相互作用的信息。基因频率若未给出，应尽量计算出。对于包括不同种族受试者的那些文献，应将每一个种族的数据分开提取。如果以上信息不完整，我们将联系通讯作者获取。

1.3文献质量评价文献质量由两名评价员依据纽卡斯尔-渥太华量表(Newcastle-Ottawa Scale，NOS)分别独立进行。评分根据研究人群选择、组间可比性和暴露因素测量三个方面，范围从质量最差的0分到质量最高的9分，7分以上视为质量较高。

1.4统计学分析采用STATA 12.0统计软件进行Meta分析，使用随机效应模型和固定效应模型计算合并OR值和 95%可信区间( 95 % CI)，使用Q检验评估研究之间的同质性，采用I2度量对异质性进行量化[9]，若各研究间存在异质性，则选用随机效应模型计算数据合并后的OR值，采用2检验验证HWE。设定Q统计量(P<0.01)、其它统计量(P<0.05)为有统计学意义[10]。使用Meta分析基于以下遗传模型检测rs10757274基因多态性与IS发病的相关性[11]：① 等位基因比较。② 隐性遗传模式。③ 显性遗传模式。采用漏斗图和Egger′s测试评估发表偏倚[12,14]，若P<0.01则认为有偏倚。

2结果

2.1纳入合格文献的特点通过系统检索中英文数据库，总共获得中英文文献共68篇。通过阅读题目及摘要，筛查出28篇可能合格的相关文献。此外，通过检索相关文献之参考文献列表获得3篇文献，共31篇文献，因重复发表的研究剔除4篇，因病例组中含有短暂性脑缺血发作(TIA)的剔除2篇，因病例组未区分缺血性或出血性脑卒中的文献剔除2篇，最终共纳入研究9p21与IS易感相关性的文献23篇。其中9篇文献[14-22]研究了rs10757274基因位点多态性，5个研究在亚洲人中进行[15-17,20,22]，3个研究在高加索人中进行[14,19,21]，1个研究同时在高加索人和非洲裔美国人中进行[18]，合计病例组6746例，对照组12577例。经检验，所有研究的对照组人群基因型频数均满足HWE，所有研究的NOS评分均在7分之上(表1)。

2.2Meta分析结果

2.2.1在总体样本人群中分析等位基因遗传模型下提示rs10757274基因多态性G等位基因与IS易感性相关(OR=1.11, 95%CI：1.06～1.16，P<0.001，图1)，各研究之间没发现异质性(I2=0%，P=0.467)。

表1　纳入研究的特点

注：HWE: Hardy-Weinberg平衡；NA: Not Available；NOS: 纽卡斯尔-渥太华量表

图1rs10757274位点多态性与IS相关性的等位基因模型分析森林图

Figure 1Forest plot of odds ratios(OR) of IS for the rs10757274 G allele versus C allele

在显性模型(AA vs GG+AG)和隐性模型(GG vs AA+AG)下，因Smith等[15]的研究未提供相应数据而不能纳入分析，其余研究合并分析发现AA基因型人群IS发病率更低，差异有统计学意义(OR=0.90,95%CI：0.82～0.98，P=0.020)，各研究之间没有发现异质性(I2=0%，P=0.64)；隐性模型下没有发现两组人群在IS发病方面存在差异(OR=1.11，95%CI：0.94～1.30，P=0.20),各研究之间存在中度异质性(I2=54%，P=0.03)。

2.2.2亚组分析我们按人种进行了亚组分析，探讨了rs10757274与不同人种IS的相关性，共分为亚洲人和高加索人两个亚组，效应量合并结果提示，在等位基因模型下，在亚洲人群和高加索人群中，rs10757274基因多态性与IS易感性存在相关性(亚洲人：OR=1.09, 95%CI:1.01～1.17，P=0.021；高加索人：OR=1.13,95%CI：1.06～1.20，P<0.001，图略)，没有发现研究间的异质性(亚洲人：I2=0.0%，P=0.684；高加索人：I2=47%，P=0.127)。在隐性模型下，仅在亚洲人群的研究显示存在较弱相关(OR=1.14，95%CI：1.00～1.29，P=0.047，没有发现异质性：I2=32%，P=0.21)；在高加索人群中没有发现相关性(OR=1.09，95%CI：0.72～1.66，P=0.69)，各研究间有高度异质性(I2=81%，P=0.005)。进一步采用逐一排除的敏感性分析检查可能的单一研究对异质性的影响，发现Luke等人[19]的研究是异质性的主要来源，排除Luke研究后研究间异质性消失(I2=0.0%，P=0.495)，但合并效应量无变化。显性模型分析提示在亚洲人和高加索人群，AA基因型人群在IS发病风险方面无统计学差异(亚洲人：OR=0.90，95%CI：0.81～1.01，P=0.07；高加索人：OR=0.86，95%CI：0.72～1.01，P=0.07)，没有发现各研究间异质性(亚洲人：I2=1%，P=0.40；高加索人：I2=0%，P=0.60)。

我们对IS亚型进行了亚组分析，但仅3个研究独立分析了大动脉粥样硬化型脑梗死(LAS)[15,17,22]，1个研究独立分析了小动脉闭塞型(SA)，因此仅对rs10757274基因与LAS相关性进行了分析。结果发现，在等位基因模型和隐性模型下均提示rs10757274基因多态性与LAS存在相关性(OR=1.18, 95%CI: 1.06～1.31，P=0.002；OR=1.33，95%CI：1.12～1.57，P=0.001，图2)，各研究间无明显异质性(I2=0.0%，P=0.79；I2=34%，P=0.22)；但在显性模型下，二者未显示相关性(OR=0.86，95%CI：0.73～1.01，P=0.06，图2)，各研究间无异质性(I2=0.0%，P=0.78)。

图2rs10757274基因位点多态性与LAS相关性的等位基因模型森林图

Figure 2Forest plot of odds ratios(OR) of LAS for the rs10757274 G allele versus C allele

2.2.3敏感性分析结果显示，依次单独剔除1篇文献后，将剩下的研究重新进行Meta分析，各合并效应量均无明显改变，提示我们的Meta分析结果是稳定可靠的，而且敏感性分析的结果也没有发现带来显著异质性的单个研究。此外，发现在等位基因模型下，Luke等的研究是异质性的主要来源。

2.2.4发表偏倚分析以等位基因模型为例，以Begg检验作漏斗图(图3)，纳入的9篇文献10个研究完整地出现在图上，以合并效应量OR值为中心散开分布，基本对称，漏斗图和Egger测试没有发现出版偏倚或者其它偏倚(P=0.544, Egger′s test)。

3讨论

研究发现，染色体9p21主要由三部分组成：INK4/ARF基因座、甲硫腺苷磷酸化酶(MTAP)基因和INK4基因座的反义非编码RNA(ANRIL)基因[23]。INK4/ARF基因座包括细胞周期蛋白激酶抑制因子编码基因2B(CDKN2B)，INK4a和ARF基因(又称细胞周期蛋白激酶抑制因子编码基因2A，CDKN2A)，共同调控细胞的增殖、衰老和凋亡[24]。有研究显示，在粥样硬化的动脉斑块中，CDKN2A和CDKN2B表达增加，表明二者与动脉粥样硬化过程有关联[25]。MTAP基因在包括表达心血管在内的正常组织中广泛表达，产物MTAP参与多胺代谢，影响细胞生长和功能[26]。ANRIL基因又称作CDKN2B-AS(CDKN2B-antisense)，可转录成一段长约3834bp的与INK4/ARF基因座呈转录反义方向的RNA，即ANRIL。研究显示，ANRIL基因在动脉平滑肌细胞、血管内皮细胞、单核巨噬细胞系统等表达增加，与动脉粥样硬化密切相关。染色体9p21的风险等位基因可能正是通过调节ANRIL的表达水平从而影响一系列血管反应，如血栓形成、血管重塑或修复以及斑块不稳定等[28]。因此，染色体9p21上的基因自然成了动脉粥样硬化研究的候选易感基因，9p21的多态性也被认为是动脉粥样硬化的独立危险因素[28]。

图3漏斗图(等位基因模型)

Figure 3The funnel plot of the G allele versus C allele

既往有研究者运用Meta分析的方法探讨了染色体9p21与IS易感相关性，但均存在一定的局限性。如存在纳入研究不全、位点有误[29]、纳入研究单一，分析不全面[30]、纳入分析病例混杂(纳入的研究中IS病例有TIA，有未区分缺血性和出血性脑卒中)[31]、提取数据有误等问题[29,31]。目前仅有1个研究进行了rs10757274与大动脉粥样硬化性缺血性卒中相关性的Meta分析，但也存在纳入研究数据错误等问题[15]。以往的Meta分析存在的这些问题均可能影响到Meta分析结果的可靠性。

本研究分析了染色体9p21区ANRIL基因位点rs10757274多态性与IS易感性的关系，与以往的Meta分析相比，我们纳入了更新更多的研究，更细致谨慎地提取了数据，特别是针对队列研究(如Yamagashi等[18]的研究)中作为对照组的人群，我们谨慎排除了已明确有颈动脉粥样硬化、外周动脉病、冠心病等动脉粥样硬化病史的对照，以使对照组更有代表性，因而我们的研究结果相对更准确可靠。

我们的Meta分析结果提示，携带G等位基因者相对于携带A等位基因者IS易感性增加，在亚洲人群和高加索人群均发现相关易感性，在亚洲人群中发现GG基因型与IS发病风险弱相关，说明rs10757274的G等位基因可能增加了IS的发病风险。而AA基因型人群发病率更低，尽管在亚组人群中没有显示这种相关性，但也说明了AA型具有保护作用。

IS根据不同发病机制分为不同的亚型，近年更有学者认为，IS不同亚型是由不同的基因变异所导致[33]。改良TOAST分型将IS分为大动脉粥样硬化型脑梗死(LAS)、心源性栓塞型(CE)、小动脉闭塞型(SA)、其他明确原因及不明原因型。所以我们对IS亚型进行了亚组分析，合并数据后发现亚洲人群携带G等位基因者LAS易感性增加了1.18倍，GG基因型人群LAS发病风险增加了1.33倍，说明亚洲人rs10757274基因的G等位基因携带者LAS的发病风险更高。

本研究也有一定的局限性。第一，由于无法获得纳入研究的详细数据，导致无法通过其他变量如年龄、性别和体重指数等来校正个体资料，可能影响结果的准确性。其中1篇文献[14]没有具体给出基因型频数，仅给出了病例总数、对照总数及等位基因模型下的OR值及其可信区间值，不能做显性遗传模型和隐性遗传模型下的分析及亚型分析，可能影响到结果的准确性；第二，纳入研究数目较少，尤其是进行亚组分析时，每个亚组的研究数目更少，可能无法全面评价rs10757274基因多态性与IS发病风险的真实联系，影响分析结果的统计效能；第三，患者的临床异质性也可能是一个混杂因素。某些研究对照组人群变异较大，包括从健康人群到其它非研究病种的住院病人；第四，关于种族的定义也存在差异，因而也不能除外种族因素对结果的影响。

4结论与展望

本文Meta分析结果提示，目前的研究表明染色体9p21SNPrs10757274基因多态性与IS易感性相关，G等位基因是IS易感的危险因素，G等位基因或GG基因型增加了亚洲人IS亚型LAS的发病风险。但是鉴于IS遗传机制的复杂性，有必要继续开展大样本、多中心、多种族的研究，深入探讨基因-基因和基因-环境交互作用在IS发生过程中的作用，以期更科学准确地评价其与IS易感性的相关性，为基础研究和临床治疗提供更可靠的证据。

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Association between rs10757274 in chromosome 9p21 and ischemic stroke: A comprehensive Meta-analysis

LIU Wei1,2,XIONG Li1, LIU Hua1, et al

(1.DepartmentofNeurology,NanchongCentralHospital&TheSecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China; 2.DepartmentofInternalMedicine,LuojiangCountyPeople′sHospital,Deyang618500,Sichuan，China)

【Abstract】ObjectiveThis study aimed to investigate the association between rs10757274 polymorphism in chromosome 9p21 and the susceptibility to ischemic stroke (IS) by using Meta-analysis; MethodsRelevant studies were identified by searching databases extensively. The quality of included studies was assessed independently using the Newcastle-Ottawa Scale(NOS). Allele and genotype frequencies for each included study were extracted. The odds ratio(OR) was calculated using a random-effects or a fixed-effects model. The Q statistic and the I2 metrics were used to evaluate heterogeneity, and a subgroup analyses was also employed to explore possible specific susceptible genes. Begg′s test and Egger′s test were used to assess publication bias; ResultsA total of 10 studies within 9 articles were included，which involved 6746 cases and 12577 controls．The results of Meta-analysis showed that the G allele of the rs10757274 polymorphism in chromosome 9p21 has an increased susceptibility to IS(OR=1.11, 95%CI: 1.06-1.16, P<0.001). The G allele or GG genotype of the rs10757274 polymorphism may increase risk of large-artery atherosclerosis stroke among Asians(Allele contrast: OR=1.18, 95%CI: 1.06-1.31，P=0.002; Recessive model: OR=1.33, 95%CI: 1.12-1.57, P=0.001). There was no obvious publication bias. ConclusionAccumulated evidence so far indicated that the rs10757274 polymorphism in chromosome 9p21 is associated with the susceptibility of IS. Future studies with larger sample sizes will be necessary to confirm the present result.

【Key words】9p21; Single nucleotide polymorphism; rs10757274; SNP; Ischemic stroke; Meta-analysis

基金项目：国家自然科学基金(81271317)，四川省科技厅科研课题(2012JY0043)

通讯作者：柳华，教授，硕士生导师，本刊编委，E-mail: hxliumedidoctor@163.com

【中图分类号】R-33; R 743.3

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.06.008

(收稿日期：2016-01-04； 编辑： 母存培)