鸡组织中泰拉霉素残留的高效液相色谱-串联质谱法检测

徐曹燕，李　琳，汤春莲，阮祥春，曾明华

(1 安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036；2 安徽省兽药饲料监察所，安徽 合肥 230091)

鸡组织中泰拉霉素残留的高效液相色谱-串联质谱法检测

徐曹燕1，李琳1，汤春莲2，阮祥春1，曾明华1

(1 安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036；2 安徽省兽药饲料监察所，安徽 合肥 230091)

[摘要]【目的】 建立鸡血浆、肌肉、肝脏、肾脏中泰拉霉素残留的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测方法。【方法】 制备鸡血浆、肌肉、肝脏、肾脏泰拉霉素加标样品，经乙腈提取，SCX固相萃取小柱净化后，40 ℃氮气吹干，用乙腈-1 mL/L甲酸水溶液(体积比为1∶1)定容，Luna C18(2)色谱柱分离，以乙腈-1 mL/L甲酸水溶液(体积比为90∶10)为流动相进行梯度洗脱，通过质谱分析进行外标法定量，再通过试验确定HPLC-MS/MS的检出限和定量限，并对血浆和肌肉、肝脏、肾脏分别进行10，20，50 μg/L 和10，20，50 μg/kg 3个水平的泰拉霉素添加回收试验。【结果】 在5～200 μg/L血浆样品和 5～200 μg/kg肌肉、肝脏、肾脏样品中，泰拉霉素含量与峰面积呈良好的线性关系(R>0.99)，血浆和肌肉、肝脏、肾脏样品中的泰拉霉素检出限依次为0.8 μg/L和0.5，0.8，0.5 μg/kg，定量限依次为2.0 μg/L和1.0，2.0，1.0 μg/kg。添加回收试验的平均回收率为80.3%～104.4%，日内相对标准偏差为5.0%～9.2%，日间相对标准偏差为5.2%～12.7%。【结论】 HPLC-MS/MS方法简便、快速、准确，可用于鸡组织中泰拉霉素药物残留的确证和定量检测。

[关键词]鸡；泰拉霉素；残留检测；高效液相色谱-串联质谱法

泰拉霉素(Tulathromycin)是一种新型的大环内酯类抗生素，其因药效高而逐渐取代了市场上广泛使用却已出现不同程度耐药性的其他大环内酯类药物。泰拉霉素给药后具有药物吸收迅速、半衰期长、生物利用度高等优点[1-3]，该药于2004年在欧盟和美国上市，我国农业部在2008年第957号公告中首次允许在动物生产中使用[4]，因此加强该药物的残留检测，对保障动物源性食品安全具有重要意义。

目前，大环内酯类药物残留的检测方法有气质联用法[5]、高效液相色谱法(HPLC)[6]、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[7-8]、超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)[9]。因泰拉霉素结构中不含发色基团，因此不能采用常规的高效液相色谱-紫外或荧光检测器测定[10]，而UPLC-MS/MS法尚未普及，对鸡组织中泰拉霉素残留检测的HPLC-MS/MS方法也尚未见报道。为此，本试验用乙腈提取样品，SCX小柱净化后采用HPLC-MS/MS多反应监测法检测鸡组织泰拉霉素的残留情况，以期为鸡肉中泰拉霉素残留检测标准的建立提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器与试剂泰拉霉素标准品，纯度大于96%，由南京森贝伽生物科技有限公司进口分装；Oasis LC-SCX柱，WATERS公司产品；甲酸、甲醇、正己烷均为色谱纯试剂，购自德国Merck KGaA Chemicals公司；氨水，国产分析纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。

MS3 Basic 型涡漩混合器、RV 10 Control旋转蒸发仪，均购自德国IKA公司；CR22G型高速冷冻离心机，购自日本HITACHI公司；MULTIVAP118型氮气吹干仪，美国Organomation 公司；AM-6型高速匀浆机，购自NISSEI精机制作所；液质联用仪，由Agilent 1100型液相系统和API 2000型三重四级杆串联质谱仪串联而成。

1.1.2试验动物1日龄罗曼蛋鸡，购自安徽省长丰县安禽禽业有限公司，于25 ℃左右的实验动物房内饲养，饲喂不含药物的饲料，自由采食饮水，饲养至21日龄用于试验。

1.2泰拉霉素标准工作液的配制

精确称取泰拉霉素标准品0.005 21 mg于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，配成1 g/L的标准储备液，-20 ℃保存。精密吸取储备液1 mL于100 mL棕色容量瓶，用乙腈-1 mL/L甲酸水溶液(体积比1∶1)定容，得质量浓度为1 mg/L的标准工作液，4 ℃冰箱保存备用。

1.3样品前处理

1.3.1血浆采集健康鸡血液，制备血浆(空白样品)，于-20 ℃冰箱保存，使用时自然解冻，摇匀。取0.5 mL空白血浆样品置于2.0 mL离心管中，加入一定量的泰拉霉素标准溶液，分别制成含10，20和50 μg/L泰拉霉素的血浆样品，于涡旋混合器上混合2 min；加0.5 mL乙腈，于旋涡混合器上混合2 min；14 000 r/min高速离心5 min，吸取上清液，过0.22 μm纤维滤膜至进样瓶，供HPLC-MS/MS分析。

1.3.2肌肉样品取健康鸡的肌肉(空白样品)于绞肉机中绞成肉泥状，于-20 ℃冰箱保存，使用时自然解冻。准确称取(2±0.02) g空白肌肉样品于50 mL聚乙烯离心管中，加入一定量的泰拉霉素标准溶液，分别制成含10，20和50 μg/kg泰拉霉素的肌肉样品，于旋涡混合器上混合2 min；加入10 mL提取液，涡旋1 min，超声5 min，5 000 r/min离心10 min；上清液移入另一离心管中，向沉淀中加入8 mL提取液重提一次。合并2次上清液，于50 ℃水浴旋转蒸发至干，加入5 mL溶解液，2 000 r/min涡旋1 min，再加入8 mL正己烷脱脂，2 500 r/min涡旋1 min，静置3 min，弃去正己烷层，再加入6 mL正己烷重复脱脂一次。下层液直接过预先用5 mL甲醇活化并用5 mL水平衡的SPE柱(流速约为1 mL/min)，5 mL水洗涤柱子，负压抽干后用5 mL洗脱液洗脱，收集洗脱液于40 ℃水浴氮气吹干。用1 mL溶解液溶解，过0.22 μm纤维素膜后上机检测。

1.3.3肝脏、肾脏样品分别准确称取(1±0.01) g肝脏、肾脏样品(空白样品)，进行前处理，处理步骤与肌肉样品一致。

1.3.4肌肉、肝脏、肾脏样品处理条件的优化为达到筛选肌肉、肝脏、肾脏样品最优的泰拉霉素提取条件，本试验选取溶解液(A)、固相萃取柱(B)、提取液(C)和洗脱液(D)4个关键因素，每个因素设3个水平进行L9(34)正交试验，具体的因素水平见表1。通过比较在肌肉、肝脏、肾脏样品中添加10 μg/kg泰拉霉素后各因素、各水平下的平均回收率，确定最佳提取条件。

表 1　泰拉霉素提取条件正交优化试验的因素与水平

1.4HPLC-MS/MS分析条件

1.4.1色谱条件色谱柱：采用美国Phenomenex公司的Luna C8与Luna C18柱，二者规格(150 mm×2.00 mm，5 μm)相同；流动相:A相+B相，分别为乙腈+2 mmol/L乙酸铵溶液(含1 mL/L甲酸)、乙腈(含1 mL/L甲酸)+2 mmol/L乙酸铵溶液(含1 mL/L甲酸)、乙腈+2 mL/L甲酸水以及乙腈+1 mL/L甲酸水溶液，梯度洗脱程序见表2；流速：300 μL/min；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。

表 2　HPLC-MS/MS分析的梯度洗脱程序

1.4.2质谱条件对1.0 μg/mL的泰拉霉素标准溶液进行母离子全扫描，扫描质量范围为100～900 amu，时间为1～2 min，使用默认值和推荐值设定主要参数的初始值，在电喷雾离子源(ESI)、正离子检测模式及多反应监测(MRM)条件下，分别对电喷雾电压(IS)、离子化温度(TEM)、气帘气(CUR)流速、雾化气流速、辅助气流速、聚焦电压(FP)、碰撞室射出电压(CXP)、碰撞气(CAD)、碰撞能量(CE)、离子对、保留时间、去簇电压进行优化。待测的母离子明显比周围的噪音离子高，通过改变DP、GS1观察离子的增减，选择适当的DP、GS1值，使喷雾平稳有效，以确定母离子和子离子。根据所确定的母离子，对其子离子进行全扫描，选择丰度较高、干扰较小的2个子离子为定性离子，以丰度最高的离子作为定量离子，改变碰撞能量(CE)值使母离子的丰度为子离子的1/3～1/4最佳。

1.5检测方法的线性范围分析

准确移取适量泰拉霉素标准工作液，用空白组织提取液配成泰拉霉素质量浓度分别为5，10，20，50，100，150，200 μg/L的系列基质标准工作液，上机检测后，以质量浓度(μg/L)为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)绘制曲线，求其线性回归方程及相关系数(R)。以信噪比为3时的泰拉霉素质量浓度为检测限(LOD)，信噪比为10时的泰拉霉素质量浓度为定量限(LOQ)，最终确定检测限和定量限。

1.6回收率和精密度测定

血浆、肌肉、肝脏、肾脏 4种空白组织样品按 1.3 的方法进行处理，获得空白提取液备用。添加泰拉霉素，对空白血浆样品和肌肉、肝脏、肾脏分别设定10，20，50 μg/L 和10，20，50 μg/kg 3个水平进行加标试验，每个水平6个平行，按1.3的方法进行处理，上机测定后计算回收率。3个添加水平在1日内重复测定3次，计算日内相对标准偏差，然后在1周内连续测定3 d计算日间相对标准偏差。

2结果与分析

2.1肌肉、肝脏和肾脏样品处理条件的优化

泰拉霉素提取条件的正交试验结果见表3，通过比较表3极差(R)得到各因素对试验结果影响的大小次序为提取液>洗脱液>固相萃取柱>溶解液；通过比较平均值k，并结合峰型得最佳提取组合为A2B3C3D2，即以乙腈为提取液，用乙腈-1 mL/L甲酸水溶液(体积比1∶1)作为旋蒸后的溶解液，用LC-SCX柱净化，40 mL/L氨甲醇溶液洗脱。

表 3　鸡肉组织中泰拉霉素提取条件的正交试验优化

注：K1、K2、K3分别为各因素各水平下平均回收率之和；k1、k2、k3为各因素各水平下平均回收率的均值；极差R=最大平均值-最小平均值。

Note:K1，K2andK3represent the average recovery rates of various factors at each level.k1，k2andk3represent the average value of average recovery rates at each level.R=max average value-min average value.

2.2色谱条件的优化

色谱柱选用Luna C18柱(150 mm×2.00 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A相)+1 mL/L甲酸水溶液(B相)，按表2进行梯度洗脱时，泰拉霉素的分离效果较好，检测灵敏度较高，且峰型对称良好，无拖尾现象出现。

2.3质谱条件的优化

优化的质谱条件：电喷雾电压(IS)为5 500 V，离子化温度(TEM)为500 ℃，气帘气(CUR)流速为N250.0 L/min，雾化气流速为N250.0 L/min，辅助气流速为N250.0 L/min，聚焦电压(FP)为400 V，碰撞室射出电压(CXP)为13.0 V，碰撞气(CAD)为高纯氮气。 在质谱ESI模式和正离子检测模式下，泰拉霉素响应良好，可以确定该药物的分子离子[M+H]+，再以[M+H]+作为母离子进行二级质谱扫描。选取干扰小、信号相对较强的2个碎片离子，与其母离子组成相应的离子对，其中以丰度高、干扰小的2个子离子为定性离子，以丰度最高的离子作为定量离子[11]。试验优化确定的离子对、保留时间、去簇电压及碰撞能量等质谱参数见表4。

表 4　泰拉霉素的保留时间和部分质谱参数

注：带*的离子对为定量分析离子对。

Note:* indicates quantitative analysis of ions.

2.4检测方法的线性范围及检出限和定量限

为消除基质效应，以基质加标做标准曲线并进行回归分析，得到回归方程和相关系数见图1。由图1可知，各方程的相关系数均大于0.99，表明在泰拉霉素含量水平为5～200 μg/kg(鸡肉、肝脏、肾脏样品)或5～200 μg/L(血浆样品)时，泰拉霉素水平与峰面积线性关系良好。泰拉霉素在血浆和肌肉、肝脏、肾脏中的LOD分别为0.8 μg/L和0.5，0.8，0.5 μg/kg，LOQ分别为2.0 μg/L和1.0，2.0和1.0 μg/kg。

图 1泰拉霉素在鸡组织中的线性回归方程和相关系数

血浆中泰拉霉素含量的单位为μg/L；肌肉、肝脏、肾脏中泰拉霉素含量的单位为μg/kg

Fig.1Linear regression equations and correlation coefficients of Tulathromycin in chicken tissues

The Tulathromycin level in plasma has a unit of μg/L;The tulathromycin levels in muscle,liver and kidney of have a unit of μg/kg

2.5检测方法的回收率和精密度

进行3个泰拉霉素含量水平(10，20和50 μg/L的血浆及 10，20和50 μg/kg的鸡肉、肝脏、肾脏)6个平行的鸡组织样品添加回收试验，空白组织样品提取液和空白组织加标样品(20 μg/kg)试验的色谱结果显示，空白组织样品的响应值很低，无目标离子出现，说明空白组织样品中无待测物；加标组织样品中，目标药物的定量离子对有明显的色谱峰。由表5可知，4种鸡组织的平均回收率为80.3%～104.4%，日内相对标准偏差为5.0%～9.2%，日间相对标准偏差为5.2%～12.7%，符合药物残留分析要求。泰拉霉素在4种鸡组织3个添加水平下的平均回收率大小表现为肌肉>血浆>肝脏>肾脏。泰拉霉素在肾脏中的回收率最低，这可能与肾脏成分较复杂而不利于药物的提取有关。

表 5　泰拉霉素在4种鸡组织中的回收率和精密度(n=6)

注：血浆样品的单位为μg/L；肌肉、肝脏、肾脏样品的单位为μg/kg。

Note:The plasma sample has a unit of μg/L;The muscle,liver and kidney samples have a unit of μg/kg.

3讨论

3.1样品前处理

3.1.1血浆样品经有机溶剂提取后再经SPE柱纯化，是药物残留提取和纯化的基本方法。但由于血浆与其他组织(肌肉、肝脏、肾脏)相比提取较容易，本研究前期试验通过比较直接提取、直接过SPE柱、过SPE柱并氮吹3种方法对样品回收率的影响发现，直接提取的回收率大于过SPE柱，过SPE柱并氮吹的回收率更低，可能因为在净化和氮吹过程中，经过溶液转移、柱子保留、淋洗和洗脱等步骤，每一步都会造成一定损失。所以本试验对血浆样品采用乙腈提取，离心后直接进行检测，该方法较简单又省时且回收率高。

3.1.2肌肉、肝脏、肾脏关于组织样品的前处理有最关键的4个因素，包括提取液、SPE柱、 溶解液和洗脱液。对于提取液，本试验分别以甲醇、1 mL/L 甲酸乙腈、乙腈作为提取溶剂进行提取，其中乙腈能更有效地沉淀蛋白，减少杂质干扰，同时也利于下一步利用固相萃取柱进行净化，因此选择乙腈作为提取液，这与倪姮佳等[12]的研究结果一致。

对于SPE柱，由于泰拉霉素属于极性化合物，并且其结构中的叔胺基可以被离子化而带上电荷，适合反相和离子交换保留机理的柱子。C18属于反相保留机理柱，净化过程中，柱中的液体不能流干否则会影响提取效率，因此只适用于小批量的样品处理[13]，不适用于大批量样品同时处理。另外，在C18柱上，样品基质中萃取的杂质会与目标物质泰拉霉素同时被保留，因此对肝、肾等比较复杂的样品净化效果不理想。而样品经MCX柱处理后，去除杂质的效果好，但是药物回收率偏低，且需要在活化和淋洗后加入磷酸盐缓冲液才能有效洗去杂质并保留目标物，操作比较复杂。LC-SCX萃取柱属于阳离子交换萃取，适用于弱碱性的大环内酯类的泰拉霉素，在净化过程中无需加入磷酸盐缓冲液调节pH值，且对于成分复杂的肝脏和肾脏净化效果较好，回收率较高。

对于溶解液，当选用乙腈-1 mL/L甲酸水溶液时，回收率较高，且峰型较好。这可能是因为弱酸性溶解液有利于弱碱性的泰拉霉素的离子化，而乙腈-2 mL/L甲酸水溶液因酸度过大而对其离子化表现出抑制作用。

对于洗脱液，大环内酯类常使用纯甲醇和氨甲醇，使用纯甲醇和含5 mL/L甲酸的甲醇回收率较低且杂峰较多，这可能是因为泰拉霉素易溶于甲醇，高含量的甲醇在洗脱过程中将杂质和样品同时洗掉，因而回收率偏低。通过正交试验，最终获得最佳前处理组合方案为：以乙腈为提取液，用LC-SCX柱净化，乙腈-1 mL/L甲酸水复溶，40 mL/L氨化甲醇洗脱。

基质效应是指分析测定中，色谱分离时的共洗脱物质改变了待测成分的离子化效率，从而引起的信号减弱或增强。喷雾离子化方法容易受样品基质的影响，从而影响测定结果的精密度和准确度。文献[12]用空白样品提取液作为标准溶液稀释液，可使标准溶液和样品溶液具有相同的离子化条件，能消除或降低基质效应。因此本研究通过基质加标可使标准溶液和样品溶液具有相同的离子化条件，从而消除了样品基质对离子化的抑制或促进作用。比较溶剂标准曲线和基质标准曲线的斜率，发现2种曲线的斜率有一定差异，说明空白基质对泰拉霉素存在基质效应，肌肉基质对泰拉霉素的离子化有促进作用，血浆、肝脏、肾脏基质对泰拉霉素的离子化有抑制作用。

3.2色谱分离条件的优化

泰拉霉素是含有弱碱性叔胺基团并具有脂溶性的极性化合物，在硅胶基固定相中易发生拖尾，因此测定中一般以高纯硅胶为基质并用端基经封尾处理的C8或C18填料作固定相[14]。本试验分别采用Luna C8与Luna C18 2种相同规格的色谱柱，分离效果无太大区别，但后者响应值较高，与C8[15]相比峰型良好且较对称，因此选用保留效果较好的C18色谱分离柱。碱性化合物的HPLC-MS/MS分析在酸性而且富含有机溶剂(甲醇、乙腈)的流动相条件下更有利于离子化，从而提高分析的灵敏度[16]。但由于甲醇分离效果不如乙腈好，因此选用乙腈作为流动相，然后通过调节流动相中缓冲溶液的pH值、离子强度和有机溶剂(乙腈)比例确定最佳流动相。本研究选用乙腈+2 mmol/L乙酸铵溶液(含1 mL/L 甲酸)、乙腈(含1 mL/L甲酸)+2 mmol/L乙酸铵溶液(含1 mL/L甲酸)、乙腈+2 mL/L甲酸水以及乙腈+1 mL/L甲酸水溶液4种流动相分别进行梯度洗脱，结果表明，在正离子模式下，有机溶剂和水相中同时含1 mL/L甲酸及仅水相中含2 mL/L甲酸时，因酸度过高而对离子化有抑制作用，另外乙酸铵主要用于解决峰型不好[12]，而本研究中当水相中仅含1 mL/L甲酸时，峰型良好对称且无拖尾现象。与流动相中添加乙酸铵相比，操作简单省时。因此最终选用响应值高的乙腈(A相)+1 mL/L甲酸水溶液(B相)作为流动相。

3.3质谱条件的优化

将1.0 μg/mL的标准溶液直接注入质谱离子源，在正离子扫描模式下，分别进行分子离子[M+H]+扫描、子离子扫描和多反应监测(MRM)分析，扫描时间为150 ms。调节锥孔电压DP值，通常DP值的优化范围为25～70 V，使分子离子对信号强度达到最大且稳定；子离子扫描时，找出子离子产生响应值较高的碎片离子对信息，改变碰撞能量(CE)值，当分子离子的强度为子离子强度的1/3～1/4时，以此时的碰撞能量(CE)值为宜[11]。最后进行MRM扫描，再次优化DP、CE值和聚焦电压 (FP)、射入电压 (EP)、喷雾电压(IS)及离子化温度(TEM)等相关参数，以确定最佳的质谱条件。

4结论

建立了鸡体内泰拉霉素残留的HPLC-MS/MS检测方法，泰拉霉素在鸡血浆、肌肉、肝脏、肾脏中的添加回收率为80.3%～104.4%，相对标准偏差为5.0%～12.7%，LOD分别为0.8 μg/L和0.5，0.8，0.5 μg/kg，LOQ分别为2.0 μg/L和1.0，2.0，1.0 μg/kg。该方法检出限、准确度和精密度均满足残留检测要求，为鸡体内泰拉霉素残留的检测奠定了基础。

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Determination of Tulathromycin residues in chicken using liquid chromatography-tandem mass spectrometry

XU Cao-yan1,LI Lin1,TANG Chun-lian2,RUAN Xiang-chun1,ZENG Ming-hua1

(1CollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui230036，China;2InstituteofAnhuiAnimalFeedandVeterinaryDrugControl,Hefei,Anhui230091,China)

Abstract:【Objective】 An analytical method based on liquid chromatography tandem mass spectrometry was developed for the determination of Tulathromycin residues in chicken tissues.【Method】 Samples were extracted with acetonitrile and cleaned-up SCX cartridge.The Tulathromycin were separated with luna C18 column by a gradient elution program with 1 mL/L acetonitrile and 1 mL/L formic acid-water as the mobile phase.The identification of Tulathromycin was carried out by positive electrospray ionization (ESI+) in multiple-reaction monitoring (MRM) mode.The quantitation was performed by the external standard method.Add and recovery experiment was also conducted with different Tulathromycin levels for plasma,muscle,liver and kidney.【Result】 There was a good linear relationship between Tara kanamycin concentration and peak area (R>0.99) in plasma (5-200 μg/L) and muscle,liver,and kidney (5-200 μg/kg).Recovery rates were 80.3% to 104.4% at three spiked levels of 10,20,50 μg/kg and the relative standard deviations (RSDs) were 5.0%-9.2% for intra-day and 5.2%-12.7% for inter-day determinations.Limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) of plasma,muscle,liver,and kidney samples were 0.8 μg/L and 0.5,0.8,0.5 μg/kg,and 2.0 μg/L and 1.0,2.0,1.0 μg/kg,respectively.【Conclusion】 The established method was simple,rapid,accurate and suitable for quantitative determination and confirmation of tulathromycin in real samples.

Key words:chicken;Tulathromycin;residue detection;high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)

DOI：网络出版时间:2016-05-0314:0510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.06.003

[收稿日期]2014-09-26

[基金项目]安徽省高校省级自然科学基金重点项目(KJ2012A115)

[作者简介]徐曹燕(1989-),女，安徽阜阳人，在读硕士，主要从事动物源性食品安全研究。E-mail:xucaoyan@126.com [通信作者]曾明华(1973-),男，安徽金寨人,副教授，硕士生导师，主要从事兽医药理学和动物毒理学研究。 E-mail：zmhzmh@ahau.edu.cn

[中图分类号]S859.84

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)06-0016-07

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