脑外伤后T型钙通道对神经干细胞增殖的诱导作用

张　熙，娄　淼，周　乐，尉春艳

(1. 西安交通大学第二附属医院神经外科，陕西西安　710004；2. 第四军医大学唐都医院神经外科，陕西西安　710004；3. 西安交通大学第二附属医院妇产科，陕西西安　710004)



◇基础研究◇

脑外伤后T型钙通道对神经干细胞增殖的诱导作用

张熙1，娄淼2，周乐1，尉春艳3

(1. 西安交通大学第二附属医院神经外科，陕西西安710004；2. 第四军医大学唐都医院神经外科，陕西西安710004；3. 西安交通大学第二附属医院妇产科，陕西西安710004)

摘要：目的探讨脑外伤后T型钙通道对神经干细胞的诱导作用及其相关机制。方法构建成年大鼠脑损伤模型，分为手术组和手术+米贝地尔组(米贝地尔组)，并另设正常对照组、假手术组。分离侧脑室壁的脑室下层(subventricular zone, SVZ)细胞，用神经干细胞悬浮培养法进行培养并鉴定其干细胞性质；在神经干细胞培养基中加入不同剂量的米贝地尔，通过计数神经干细胞球、噻唑蓝(MTT)法分析米贝地尔对神经干细胞增殖抑制作用，计算米贝地尔对神经干细胞的半抑制浓度(IC50)，Western blot法检测脑组织中Cav3.2以及神经干细胞中Cav3.2、Cyclin A和caspase-3的蛋白表达。结果体内实验表明，手术组中神经干细胞的增殖能力显著高于正常对照组和假手术组，应用米贝地尔腹腔注射抑制脑组织中T型钙通道后，神经干细胞的增殖明显降低。体外细胞实验表明，米贝地尔能够明显抑制神经干细胞球的形成，MTT法显示米贝地尔浓度大于5 μmol/L时，可显著抑制细胞增殖，5、10、20 μmol/L组的吸光度(A值)与对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。IC50值为8.93 μmol/L。Western blot检测结果显示，米贝地尔组的Cav3.2蛋白和Cyclin A蛋白的表达显著降低，caspase-3蛋白的表达显著升高。结论脑外伤后可激活脑组织中T型钙通道，上调神经干细胞的增殖能力。

关键词：脑外伤；神经干细胞；T型钙通道；米贝地尔；细胞周期；Cav3.2；Cyclin A；caspase-3

KYT WORDS: brain injury; neural stem cell; T type calcium channel; mebefradil; cell cycle; Cav3.2; Cyclin A; caspase-3

中枢神经系统损伤是最常见的神经外科疾病，往往导致长期昏迷、瘫痪、认知力下降等后遗症，给家庭和社会造成极大的负担。神经干细胞能够在不同微环境下向不同的神经细胞分化，在损伤导致的脑功能障碍的修复中可发挥作用。但是，内源性神经干细胞来源稀少，自我修复的能力有限，外源性神经干细胞又面临着成瘤性、定向诱导分化等困难。T型钙离子通道是低电压激活的钙离子通道，广泛表达于脑组织中，调控脑功能[1]。其与细胞增殖密切相关。抑制T型钙通道表达可抑制Cyclin A、Cyclin D等细胞周期蛋白，阻断细胞周期进程，抑制细胞增殖。有研究表明，脊髓损伤后能够诱导T型钙离子通道的表达上调，但在脑组织中尚无相关研究[2]。米贝地尔是特异性的T型钙通道阻滞剂。本研究主要探讨脑损伤对内源性神经干细胞的诱导作用以及T型钙离子通道在该过程中的作用。

1材料与方法

1.1主要材料与试剂成年8周龄SD大鼠24只，清洁级，雄性，体质量200～250 g，由西安交通大学医学部实验动物中心提供。表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、重组碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)购自GIBCO公司，Nestin抗体、GFAP抗体、NSE抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，米贝地尔和caspase-3抗体购自Sigma公司，Cav3.2抗体购自Santa Cruz公司。

1.2实验分组及动物模型的建立随机分为正常对照组(6只)、假手术组(6只)、手术组(6只)和手术+米贝地尔组(即米贝地尔组，6只)。按文献[3]的方法，用液压损伤法建立可靠的动物模型，即0.12 mol/L的苯巴比妥钠经腹腔麻醉(30 mg/kg)，无菌条件下，沿头颅矢状缝做长约1 cm正中切口，暴露颅骨外板，在头颅立体定位仪引导下，在冠状缝后2.3 mm，矢状缝旁开1.5 mm的右侧顶叶选取坐标点，用颅骨钻打开颅板，显示硬脑膜，将打击管埋置于硬脑膜外，并用牙托水泥固定。24 h后以0.2 MPa的压力冲击右侧顶叶皮质，造成中度侧位液压冲击脑损伤。假手术组不用液压冲击，正常对照组不进行手术。米贝地尔组每日腹腔注射米贝地尔(15 mg/kg，2次/d)，溶于含有0.5 g/L二甲基亚砜的100 μL的生理盐水中，其余各组腹腔注射100 μL含0.5 g/L二甲基亚砜的生理盐水。

1.3神经干细胞的分离培养与鉴定术后7 d，0.12 mol/L苯巴比妥钠30 mg/kg腹腔麻醉各组动物，以室下区为中心，迅速切取长约1.0～1.5 cm脑组织并置入冰冷的D-hanks液中，沿侧脑室面切取室下区，修去损伤区附近的脑组织后，部分备做Western blot检测，其余部分尽量剪成小于1 mm3的组织碎屑，用含1 g/L胰蛋白酶、0.67 mg/mL透明质酸酶和0.1 mg/mL DNA酶的混合酶液，在细胞培养箱消化30 min，移入预先已加有等体积的1.25 g/L大豆胰酶抑制剂的离心管内，反复吹打，铜网过滤并将滤液收集入离心管内，800 r/min离心5 min，弃去上清液，用基础培养基重悬沉淀细胞，800 r/min离心5 min。重复5～6次后，用神经干细胞完全培养基重悬细胞，经锥虫兰(台盼蓝)鉴定细胞活力后，调整细胞密度约为50 000～100 000个/mL，种入培养瓶内悬浮培养。接种24 h后更换培养液，以后每隔7 d半量换液。以上过程均在无菌间内完成。

单细胞悬液行抗Nestin免疫染色检测，鉴定是否为神经干细胞。将培养获得的神经干细胞用含有100 mL/L胎牛血清的神经干细胞培养液进行诱导，诱导结束后，检测神经元标记物NSE和星形胶质细胞标记物GFAP的表达，鉴定神经干细胞的多向分化潜能。

1.4MTT检测米贝地尔对神经干细胞增殖的影响培养得到的神经干细胞克隆球用机械法传代，取第2代细胞，获取单细胞悬液，以1 000～10 000个/孔接种于96孔板，每孔200 μL，37 ℃孵箱(950 mL/L O2和50 mL/L CO2)培养24 h。按米贝地尔浓度以0、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L分6组，于96孔板内，37 ℃、950 mL/L O2、50 mL/L CO2继续培养48 h。另设空白对照组。每组6孔。48 h后，每孔加5 mg/mL MTT液20 μL，作用4 h后，将96孔板置离心机内1 000～2 000 r/min离心5 min，使细胞球贴壁；吸弃培养基，加入DMSO 100 μL/孔，室温下摇床震荡10 min，酶标仪检测各孔570 nm波长下吸光度(A值)。并根据A值计算半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)和增殖抑制率。增殖抑制率=1-(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)。

1.5Western blot检测Cyclin A、Cav3.2和caspase-3蛋白的表达将留取的室下区组织碎屑提取总蛋白，经100 g/L十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至聚偏氟乙烯膜。封闭2 h后与兔抗鼠Cav3.2蛋白(1∶500)孵育过夜，二抗孵育1 h，化学发光显色，以β-actin为内参校正。

另提取获得的神经干细胞的总蛋白，根据IC50值在实验组中加入米贝地尔，同时设立对照组，48 h后同上进行检测Cyclin A、Cav3.2和caspase-3蛋白(1∶500)的表达。

1.6统计学分析采用SPSS 13.0统计软件，组间比较进行独立样本t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1神经干细胞的鉴定细胞接种3 d后，培养瓶中可见干细胞球形成，显微镜下干细胞球由数十个细胞聚集而成，较紧密，大小不均等，细胞边缘光滑、中心膨隆，形态上与简单的细胞聚集有明显差别；培养5～7 d后，这些干细胞球由数百个细胞组成，中心折光度差，色发暗(图1)。细胞传代后培养瓶中仍然可以长出类似的细胞球，且数目明显增多，细胞碎屑明显减少(图2)。

图1原代培养的神经干细胞形态Fig.1 Neural stem cell morphology in primary culture (×40)

A：原代培养第3天；B：原代培养第6天。

图2第1次传代培养的神经干细胞形态Fig.2 Neuralstem cell morphology after the first passage (×40)

A：第1次传代第3天；B：第1次传代第6天。

免疫荧光检测提示干细胞球中Nestin蛋白表达阳性。按照1.3方法进行诱导分化2 d后，可见大量细胞从干细胞球内迁移，并开始形成短小的突起，1周后镜下可见细胞形态成熟(图3)。

图3神经干细胞诱导分化后的形态

Fig.3 Neuralstem cell morphology after induction and differentiation (×40)

A：诱导分化第1天；B：诱导分化第7天。

进一步进行免疫荧光染色，可见一部分细胞表达GFAP蛋白，一部分细胞表达NSE蛋白，提示大部分为胶质细胞，尤以星形胶质细胞为主，神经元较少，散在分布，细胞突起相互间交织成网状(图4)。由此可见，所分离的细胞能够表达神经干细胞标志物Nestin蛋白，能够形成干细胞球，还能够诱导分化为胶质细胞和神经元，具备多分化潜能。因此，我们分离得到的细胞为神经干细胞。

图4神经干细胞免疫荧光染色的结果

Fig.4 Immunofluorescence staining of neural stem cells (×40)

A：干细胞球的Nestin染色；B：诱导分化后GFAP染色；C：诱导分化后NSE染色。

正常对照组、假手术组和米贝地尔组获得的神经干细胞培养5～7 d后，培养瓶中干细胞克隆球数目明显少于手术组，且克隆球直径小，外观不规则(图5)。

图5原代培养第6天各组中神经干细胞球数量及形态

Fig.5 The number and morphology of neural stem cell spheres in different groups in primary culture at day 6 (×40)

A：正常对照组；B：假手术组；C：手术组；D：米贝地尔组。

2.2米贝地尔对神经干细胞球增殖的抑制作用按照1.4方法干预后第4天观察各组神经干细胞球的形成情况。空白对照组未加米贝地尔，细胞增殖快，镜下见大量细胞球，细胞球形态规则，边缘光滑，中心膨隆有立体感，未见皱缩细胞及细胞碎片。随着药物浓度增大，镜下细胞球数量逐渐减少，直径也随之减小，形态尚规则，并可见越来越多的皱缩细胞。至10 μmol/L组，镜下仅见数十个细胞组成的小细胞球，且细胞球数目极少，周围有大量细胞碎片。20 μmol/L组，镜下未见正常形态的神经干细胞及神经球，视野中全部为死亡细胞皱缩形成的细胞碎片(图6)。

2.3MTT检测结果体外实验表明，1.25 μmol/L组及2.5 μmol/L组A值较对照组稍降低，但细胞增殖抑制率差异无统计学意义。5、10、20 μmol/L组与对照组比较，细胞增殖抑制率差异均有统计学意义，且随着浓度增加(≥5 μmol/L)，米贝地尔对神经干细胞的增殖抑制作用越明显(图7)。计算得IC50出现在8.93 μmol/L。

图6加入米贝地尔后各组神经干细胞球数量及形态

Fig.6 The number and morphology of neural stem cell spheres in each group after adding different concentrations of mibefradil (×40)

A：对照组；B：米贝地尔1.25 μmol/L组；C：米贝地尔2.5 μmol/L组；D：米贝地尔5 μmol/L组；E：米贝地尔10 μmol/L组；F：米贝地尔20 μmol/L组。

2.4Cav3.2蛋白的表达手术组中室下区组织中Cav3.2蛋白的表达显著高于正常对照组和假手术组；米贝地尔腹腔注射后，室下区组织中Cav3.2蛋白较手术组明显降低(图8)。

2.5Cyclin A、Cav3.2和caspase-3蛋白的表达综合考虑IC50值、实验可操作性等因素后，并根据MTT检测中加入的米贝地尔浓度，将加入神经干细胞中的米贝地尔浓度定为距离IC50值最接近的整数值，即10 μmol/L。加入米贝地尔48 h后，Cav3.2蛋白和Cyclin A蛋白的表达明显下调，caspase-3蛋白的表达明显上调(图9)。

3讨论

颅脑外伤是常见的神经外科疾病，发病突然，病情重，常常造成长期昏迷、瘫痪、认知障碍、语言功能障碍等后遗症，给家庭和社会造成极大的负担。神经干细胞能在不同微环境中分化为不同的神经细胞，可修复不同的神经功能障碍，在颅脑外伤的治疗中有光明前景[4]。目前分离培养神经干细胞的技术日趋成熟，但是，外源性神经干细胞的应用也存在着缺陷：定向诱导分化机制尚没有完全明确，微环境的调控技术复杂，无法完全达到按人的意志进行分化；神经干细胞存在成瘤性[5]。因此，应用内源性神经干细胞，利用脑组织中天然的微环境调控其分化具备一定的优势。但是，内源性神经干细胞数量稀少，远远不能满足损伤修复的需要[6]。本课题组的前期研究证明，颅脑损伤后可诱导室下区神经干细胞形成，其增殖能力明显增加[7]，但是机制尚不清楚。

图7加入米贝地尔后各组细胞增殖抑制率(MTT法)

Fig.7 Proliferation inhibition rate in each group after adding different concentrations of mibefradil (MTT method)

与对照组比较，1.25 μmol/L组P=0.06，2.5 μmol/L组P=0.07，5 μmol/L组P=0.001，10 μmol/L组P=0.000，20 μmol/L组P=0.000。

图8各组室下区组织Cav3.2蛋白的表达(Western blot)

Fig.8 The expression of Cav 3.2 protein in subventricular zone in each group (Western blot)

A：正常对照组；B：假手术组；C：手术组；D：米贝地尔组。

图9Cav3.2、Cyclin A和caspase-3蛋白的表达(Western blot)

Fig.9 Expressions of Cav3.2, Cyclin A and caspase-3 protein (Western blot)

T型钙离子通道又名低电压激活钙通道，与高电压激活钙通道相比，具有易激活、失活缓慢、需要的电压阈值较低等特点[8]。T型钙通道家族包括3种T型钙通道亚型：Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3广泛表达于脑组织中，主要位于下橄榄核、丘脑、海马、下丘脑、室旁核、脑干网状结构、小脑深部核团、苍白球以及丘脑底核等[9]。研究表明，Cav3.1蛋白主要位于神经元胞体和树突近端，Cav3.2蛋白主要位于神经元胞体和树突近端至中间部分，Cav3.3蛋白主要表达于特定类型细胞的胞体及树突[10]。T型钙离子通道主要存在于细胞的G1～S期，对细胞增殖有十分重要的作用[11-12]。外伤能够上调细胞内T型钙离子通道的表达[2]。有学者认为，T型钙离子通道蛋白也表达于胚胎干细胞中，维持干细胞的多分化潜能[13]。本研究表明，颅脑外伤后，脑组织中T型钙离子通道的表达明显上调，神经干细胞的增殖能力明显上调。米贝地尔是选择性T型钙离子通道阻滞剂，能够抑制Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3蛋白表达[14-15]。应用米贝地尔腹腔注射可抑制脑内T型钙离子通道的表达，脑组织内神经干细胞的增殖能力明显降低。体外实验也表明米贝地尔可抑制神经干细胞的增殖。因此，颅脑外伤激活T型钙离子通路对神经干细胞有重要的诱导作用。Cyclin A的合成发生于G1期向S期的转变过程中，在中期时消失，属S期周期蛋白[16]。米贝地尔能够明显抑制Cyclin A蛋白的表达，上调caspase-3蛋白的表达，说明其可通过抑制细胞周期进展，尤其抑制是G0/G1期向S期进展，导致细胞凋亡，抑制神经干细胞的增殖，但是具体的机制还需要进一步的研究。

参考文献：

[1] ENGBERS JD, ANDERSON D, ZAMPONI GW, et al. Signal processing by T-type calcium channel interactions in the cerebellum[J]. Front Cell Neurosci, 2013, 27(7):230.

[2] YUE J, LIU L, LIU Z, et al. Upregulation of T-type Ca2+channels in primary sensory neurons in spinal nerve injury[J]. Spine (Phila Pa 1976), 2013, 38(6):463-470.

[3] 傅西安，高国一，蒲军，等. PPAR-γ在液压脑损伤大鼠皮层的表达[J]. 中华神经外科疾病研究杂志, 2014, 13(4):326-328.

[4] LOZANO D, GONZALES-PORTILLO GS, ACOSTA S, et al. Neuroinflammatory responses to traumatic brain injury: etiology, clinical consequences, and therapeutic opportunities[J]. Neuropsychiatr Dis Treat, 2015, 8(11):97-106.

[5] NGRYEN TD, WIDERA D, GREINER J, et al. Prolonged cultivation of hippocampal neural precursor cells shifts their differentiation potential and selects for aneuploid cells[J]. Biol Chem, 2013, 394(12):1623-1636.

[6] XIAO L, SAIKI C, IDE R. Stem cell therapy for central nerve system injuries: glial cells hold the key[J]. Neural Regen Res, 2014, 9(13):1253-1260.

[7] 屈建强，贺西京，杨平林，等. 液压性脑损伤后室下区神经干细胞的分离培养与鉴定[J]. 中华神经外科疾病研究杂志, 2007, 6(5):396-399.

[8] 吕楠，肖波. T型钙离子通道在癫痫发生中的作用研究进展[J]. 中国神经精神疾病杂志, 2013, 39(7):447-449.

[9] CHEONG E, SHIN HS. T-type Ca2+channels in normal and abnormal brain functions[J]. Physiol Rev, 2013, 93(3):961-992.

[10] MCKAY BE, MCRORY JE, MOLINEUX ML, et al. Ca(V)3 T-type calcium channel isoforms differentially distribute to somatic and dendritic compartments in ratcentral neurons[J]. Eur J Neurosci, 2006, 24(9):2581-2594.

[11] DAS A, PUSHPARAJ C, HERREROS J, et al. T-type calcium channel blockers inhibit autophagy and promote apoptosis of malignant melanoma cells[J]. Pigment Cell Melanoma Res, 2013, 26(6):874-885.

[12] YU W, WANG P, MA H, et al. Suppression of T-type Ca2+channels inhibited human laryngeal squamous cell carcinoma cell proliferation running title: roles of T-type Ca2+channels in LSCC cell proliferation[J]. Clin Lab, 2014, 60(4):621-628.

[13] RODRIQUEZ-GOMEZ JA, LEVITSKY KL, LOPEZ-BARNEO J. T-type Ca2+channels in mouse embryonic stem cells: modulation during cell cycle and contribution to self-renewal[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2012, 302(3):C494-504.

[14] LU Y, LONG M, ZHOU S, et al. Mibefradil reduces blood glucose concentration in db/db mice[J]. Clinics (Sao Paulo), 2014, 69(1):61-67.

[15] WEN XJ, XU SY, CHEN ZX, et al. The roles of T-type calcium channel in the development of neuropathic pain following chronic compression of rat dorsal root ganglia[J]. Pharmacology, 2010, 85(5):295-300.

[16] DAI L, LIU Y, LIU J, et al. A novel cyclinE/cyclinA-CDK inhibitor targets p27(Kip1) degradation, cell cycle progression and cell survival: implications in cancer therapy[J]. Cancer Lett, 2013, 333(1):103-112.

(编辑国荣)

收稿日期：2015-09-19修回日期：2015-11-29

基金项目：陕西省社会发展攻关项目资助(No.2014K11-01-01-12)

通讯作者：尉春艳. E-mail: weichy1023@163.com.

中图分类号：R651

文献标志码：A

DOI:10.7652/jdyxb201604004

T type calciumchannel activated by brain injury induces neural stem cell proliferation

ZHANG Xi1, LOU Miao2, ZHOU Le1, WEI Chun-yan3

(1. Department of Neurosurgery, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710004; 2. Department of Neurosurgery, Tangdu Hospital of Fourth Military Medical University, Xi’an 710004; 3. Department of Obstetrics and Gynecology,the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the mechanism and induction of T type calcium channel on neural stem cells after brain injury. MethodsAdult mice brain injury model was established and divided into control, sham operation, surgery, and surgery+mebefradil groups. Neural stem cells were separated from the subventricular zone (SVZ) and identified. Moreover, we analyzed the results using MTT and neural stem cell sphere counting after adding different doses of mibefradil in culture medium, respectively. Then we calculated the half maximal inhibitory concentration (IC50) of mibefradil on neural stem cells. Finally, we analyzed the expression of Cav3.2 in SVZ and the protein expressions of Cav3.2, Cyclin A and caspase-3 in neural stem cells by Western blot. ResultsIn vivo, neural stem cell proliferation was increased in surgery group compared with that in control and sham-operation groups. The proliferation of neural stem cells in surgery+mibefradil groups was significantly decreased compared with that in surgery group after mibefradil-induced inhibition of T type calcium channel protein. In vitro, the formation of neural stem cell sphere was significantly inhibited after adding mibefradil. The cell growth ratio was significantly decreased when the concentration of mibefradil was above 5 μmol/L. A values in 5 μmol/L, 10 μmol/L and 20 μmol/L groups were significantly lower than those in control group (P<0.05). IC50 was 8.93 μmol/L. The protein expressions of Cyclin A and Cav3.2 were inhibited while that of caspase-3 was increased after mibefradil treatment. ConclusionNeural stem cell proliferation was enhanced by activating T type calcium channel after brain injury.

Supported by Shaanxi Social Development Project (No.2014K11-01-01-12)

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160608.0917.008.html(2016-06-08)