复方醋酸地塞米松乳膏抑菌剂含量测定及其抑菌效力评价

林琳

(哈尔滨医科大学附属第二医院，老年病教研室，黑龙江 哈尔滨 150000)

复方醋酸地塞米松乳膏抑菌剂含量测定及其抑菌效力评价

林琳Δ

(哈尔滨医科大学附属第二医院，老年病教研室，黑龙江 哈尔滨 150000)

目的 建立高效液相色谱法测定复方醋酸地塞米松乳膏中抑菌剂的含量, 并评价抑菌剂使用的合理性。方法 采用HPLC方法，以外标法测定羟苯乙酯含量。参照《中国药典》2015年版抑菌剂效力检查法；采用大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉共5 种试验菌株进行抑菌剂效力测定。结果 羟苯乙酯在6.63～132.6 μg/mL浓度范围内呈良好线性关系Y=4 216.2X+0.320 8，r=0.999 7，平均回收率为99.2%。不同批次的供试品的抑菌效力因抑菌剂含量不同而效果不一。结论 本方法结果准确,重复性好,可用于复方醋酸地塞米松乳膏中羟苯乙酯含量的测定。目前抑菌剂的使用存在随意性,需加强研究和监管。

复方醋酸地塞米松乳膏；羟苯乙酯；含量测定；抑菌效力

复方醋酸地塞米松乳膏为皮肤外用药，具有抗炎、抗过敏的作用，因其适用于各种皮炎、湿疹等常见病[1-3]，且疗效迅速确切，深受患者欢迎，其质量标准收载于《中国药典》2015年版二部[4]。不同于口服制剂，软膏剂多为多剂量包装，在使用过程中，不可避免的接触外来物，为了防止污染，多数制剂中都添加适宜的抑菌剂。通过调查发现市售多个厂家不同批次的复方醋酸地塞米松乳膏中都使用羟苯乙酯(尼泊金乙酯)作为抑菌剂，但处方中均未给出具体含量。本文采用HPLC法测定复方醋酸地塞米松乳膏中羟苯乙酯的含量，然后对不同含量抑菌剂的样品进行抑菌剂效力测定，对样品中抑菌剂添加量使用的合理性进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂：羟苯乙酯对照品(100847-201203，纯度100%，购自中国食品药品检定研究院)。甲醇为色谱纯；其余试剂均为分析纯。菌种:细菌包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B) 26003]、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B) 10104]、大肠埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B) 44102]，真菌包括白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F) 98001]、黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F) 98003]，均购自中国食品药品检定研究院，菌种传代3次后使用。

培养基：沙氏葡萄糖液体培养基(SDB)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)、胰酪大豆胨液体培养基(TSB)、胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)、pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液均购自北京陆桥技术股份有限公司。各培养基经适用性试验，结果全部符合《中国药典》2015年版相关要求。

1.1.2 实验仪器：1260型全自动高效液相色谱仪配DAD检测器(安捷伦)；AB304S型电子天平(上海梅特勒一托利多仪器有限公司)；BT-25S型电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)；TU1801紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；BSC-1300ⅡA2生物洁净安全柜(上海苏净实业有限公司)；SPX-150B-Z型恒温培养箱(上海博迅实业有限公司)； BS210S电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]YXQ-LS-100A型立式压力蒸气灭菌器(上海博迅实业有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 抑菌剂含量测定方法

① 色谱条件：色谱柱：Hypersil ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，0.5μm)；流动相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(35:65)；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长为256 nm。

② 溶液的制备：精密称取羟苯乙酯对照品13.26 mg,置100 mL 量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，作为对照品储备液。取供试品内容物约2.0 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇适量，70 ℃水浴加热，时时振摇，至样品完全溶解，加甲醇稀释至刻度，放冷，置冰浴中冷却2 h以上，取出后用0.22 μm微孔滤膜迅速滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

③ 线性关系考察：精密量取对照品储备液0.5、1.0、2.0、4.0、10.0 mL，用甲醇定容至10 mL，分别进样，计算峰面积，以羟苯乙酯浓度(μg/mL)为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线。

④ 精密度考察：在①色谱条件下，精密吸取②对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，重复进样6次。

⑤ 稳定性考察：取②项下供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12 h时进样。

⑥ 重复性考察：取②项下供试品溶液5份，分别精密吸取20 μL，按照色谱条件测定，结果羟苯乙酯峰面积的RSD为1.4%。

⑦ 回收率试验：精密称取复方醋酸地塞米松乳膏(批号)约2 g，共取9份，置50 mL量瓶中，按不同浓度分别精密加入对照品溶液1.0，2.0和3.0 mL，平行加入3份，加甲醇适量，70 ℃水浴加热，时时振摇，至样品完全溶解，加甲醇稀释至刻度，放冷，置冰浴中冷却2 h以上，取出后用0.22 μm微孔滤膜迅速滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按上述色谱条件下进行测定。

1.2.2 抑菌效力测试方法

① 细菌培养物的制备：将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌接种在TSA培养基斜面上，将其置于的培养箱中，培养箱温度设置到35 ℃，24 h后,用适量无菌0.9%氯化钠溶液洗脱各培养基表面的培养物，采用比浊法制成每mL含菌数约为108cfu的菌悬液。

② 真菌培养物的制备：白色念珠菌接种到SDA斜面上，将其置于的培养箱中，培养箱温度设置到25 ℃，48 h后,用适量无菌0.9%氯化钠溶液洗脱培养基表面的培养物，制备成浓度为108cfu/mL的菌悬液。

黑曲霉采用SDA，同样置温度设为25 ℃培养箱中，不同白色念珠菌的是培养时间为7 d。孢子悬液的制备方法如下：取新鲜培养物，使用0.05%(mL/mL) 聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液作为洗脱液，并用无菌试管收集孢子悬液，用适量上述洗脱液稀释并制成每1 mL含孢子数108cfu的孢子悬液。

1.2.3 微生物计数方法适用性试验：因为复方醋酸地塞米松乳膏对真菌，特别是白色念珠菌有抑制作用。因此，细菌计数试验时可采用常规法，真菌的抑制作用可以用薄膜过滤法来消除。

① 供试液的制备：取样品约10 g，置锥形瓶中，加无菌十四烷酸异丙酯30 mL，充分振摇使溶解，加入预先在40 ℃保温的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH 7.0)至100 mL，振摇5-10 min，萃取，静置，油水分层后，取水层作为1:10的供试液。

② 细菌计数方法适用性试验：取供试液1 mL和试验菌(<100 cfu)的，分别注入同一平皿中，立即倾注TSA，按常规法测定其菌落数。

③ 真菌计数方法适用性试验：取“1.2.2项下②”项下菌悬液(<100 cfu)，加1mL供试液作为试验菌液, 用无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH 7.0)至100 mL，通过薄膜过滤器后，用冲洗液冲洗2次，每次200 mL，转膜贴至平板上,测定菌数。

1.2.4 抑菌效力试验

① 供试液制备：供试品的制备方法同“1.2.3”项下“①”。4个厂家共5批样品，平行制备5份。

② 供试品接种：取上述供试液，置于无菌试管中，直接接种100 μL 的“2.2. 1”项下的制备好的菌悬液，最终含菌量为105～106cfu/mL，密封摇匀，置于培养箱(25 ℃)中培养待用。

③ 存活菌数测定：根据《中国药典》抑菌效力判定标准规定的间隔时间，于供试品接种的2、7、14、28 d，分别取“1.2.4”项“①”中接种的各供试品1 mL，稀释成适当的稀释级，分别采用上文验证后的微生物计数方法进行菌落计数。

2 结果

2.1 线性关系考察 得回归方程Y=4216.2X+0.3208，相关系数r=0.9997，结果显示对照品溶液在6.63～132.6 μg/mL线性范围内与峰面积呈良好线性。

2.2 精密度考察 测得羟苯乙酯峰面积的RSD为0.46%，表明仪器精密度良好。

2.3 稳定性考察 测得羟苯乙酯峰面积的RSD为1.1%，表明在12 h内供试品溶液稳定性良好。

2.4 重复性考察 算得羟苯乙酯峰面积的RSD为1.4%，表明方法重现性良好。

2.5 回收率试验 平均回收率为99.2%，RSD为1.6%，结果表明方法准确度良好。

2.6 样品含量测定 文中对市售的6个批号的样品按照上述色谱条件进行羟苯乙酯含量的测定，含量在0.04%～0.11%，不同厂家的羟苯乙酯含量相差较大，同一厂家不同批号的样品含量也不同。见表1。

表1 羟苯乙酯的含量测定结果(%)

2.7 微生物计数方法适用性试验结果 验证结果表明，细菌计数试验时采用常规法，真菌的计数试验采用薄膜过滤法，回收率高于70%，符合规定。见表2。

表2 计数方法实验结果

2.8 抑菌效力试验结果 通过查阅皮肤给药制剂抑菌效力判断标准，其中要求细菌的2 d减少的lg值不小于2,7 d减少的lg值不小于3,28 d试验菌增加数量不超过0.5 lg；真菌的14 d减少的lg值不小于2，28 d试验菌增加数量不超过0.5 lg。由表4 结果可知，5个批次的样品抑制真菌的能力都符合标准的规定，14 d后基本上无菌落生长，28 d后也无复生长的现象。但样品中不同浓度的羟苯乙酯对细菌的抑制能力从表3中来看，2号作为低浓度抑菌剂的代表，其抑菌效力无法满足实际需要，达不到A类产品的规定要求， 而5号样品浓度略高，基本能符合抑菌力检查的规定。另外3个批次的样品抑菌效力大大超过了规定的lg值，提示有过量添加的可能性。5批次样品的测定结果见表3、4。

表3 样品抑菌效力测定结果(细菌)

表4 样品抑菌效力测定结果(真菌)

3 讨论

参考相关文献[5-8]文中先后比较了甲醇-水、乙腈-水和甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液作为流动相，发现乙腈-水作为流动相时峰形较宽，调整使用了不同比例的甲醇-水作为流动相，结果分离度偏小，故采取加入磷酸盐的方法。试验证明甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(35:65)作为流动相对主成分和羟苯乙酯有良好的分离效果。

文中试验结果发现同一厂家不同批次的抑菌剂添加量差别较大，有的相差一倍以上，存在随意性。同时也发现不同厂家抑菌剂添加量不同，存在过度使用的问题。分析其原因可能生产厂家对合理使用抑菌剂主观重视程度不够，认为只要能达到效果，量多量少差别不大。但本文试验表明，抑菌剂的添加量不足，则会达不到对细菌的抑菌效果，如添加量过大虽然可以保证抑菌效力，但其潜在的毒性也需引起重视[9-12]。故药企需要按照新版药典(通则1121)的要求，采用含不同种类不同浓度抑菌剂的样品多次试验，甚至可以采用复方组成，找到最佳配比[13-15]，保证用药安全。

抑菌剂作为软膏处方中必要的组成部分应该引起药企和监管部门的重视，《中国药典》2015 年版已经将抑菌效力由原来的指导原则[16]升级为抑菌效力检查法(通则1121)的要求。但国内大多数的软膏剂的说明书仅标注抑菌剂名称，对其含量讳莫如深。除了部分滴眼液外，药品质量标准对抑菌剂的检验也存在缺失现象。建议在日常监管和国家评价性抽验中，积极探索软膏剂抑菌剂的检验方法，深入研究，了解抑菌剂的使用现状，为制订更为科学严格的药品质量标准夯实基础。

[1] 谢桂群.复方醋酸地塞米松乳膏治疗PICC 相关湿疹的疗效观察[J].现代医药卫生，2013，29(4)：611-612.

[2] 高莹，甄甄，张勤，等. 0.025%醋酸地塞米松乳膏联合肤乐霜治疗婴幼儿湿疹、特应性皮炎的随机对照研究[J].北京医学，2015，37(2)：145-147.

[3] 邱艳红. 糖皮质激素类药物的临床使用情况分析[J].海峡药学，2015，27(4)：220-221.

[4] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典(四部)[S].2015年版.北京：化学工业出版社：23-24.

[5] 林琪珊，洪淑华，余良钟. 复方醋酸地塞米松乳膏有关物质的测定及其杂质的确定[J].中国药房，2013，24(9)：843-845.

[6] 简炎林,邹国芳. 医院制剂中防腐剂羟苯乙酯的含量测定[J].中国药房，2009，20(13)：1016-1017.

[7] 焦旭雯，张雷，陈华. HPLC 法测定麦芽糖铁糖浆中防腐剂的含量[J].中国生化药物杂志，2015，35(11)：169-171.

[8] 孙蒙，闫小玉，毕开顺，等. HPLC 测定 11 种中药口服液中 6 种防腐剂的含量[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(3)：76-79.

[9] 李中东，张云轩，郭燕萍，等.羟苯酯类防腐剂的不良反应[J].中国药物警戒，2012，9(5)：303-305.

[10] 林忠洋，马万里，齐迹，等.对羟基苯甲酸酯类防腐剂的人体暴露[J].化学进展，2015，27(5)：614-622.

[11] 成海平. 药品研发中防腐剂的应用及质控[J].中国新药杂志，2005， 14(8) : 954 -956.

[12] 吴朝阳.浅谈注射剂中抑菌剂引起的不良反应[J].中国医学工程，2012，20(3) : 180-181.

[13] 傅蓉， 王超， 赵晓冬，等. 左氧氟沙星滴眼液抑菌剂剂量筛选与抑菌效力研究[J].药物分析杂志，2013，33(12)：2056-2060.

[14] 刘艳，牟卫伟，王丽英，等. 硝酸毛果芸香碱滴眼液抑菌剂浓度筛选与抑菌效力研究[J].中国药事，2014，28(12)：1313-1317.

[15] 丁勃，徐晓洁，谢元超.氢溴酸加兰他敏口服液添加抑菌剂筛选与抑菌效力研究[J].药物分析杂志，2011，31(12)：2312-2317.

[16] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典(二部)[S].2010年版.北京：化学工业出版社，2010：附录215-216.

(编校：王冬梅)

Determination of the antibacterial agent content of compound dexamethasone acetate cream and its antibacterial effect evaluation

LIN LinΔ

(Department of Geriatrics, The Second Affiliated Hospital Harbin Medical University, Harbin 150000, China)

ObjectiveTo establish a HPLC method to determine the antiseptics in compound dexamethasone acetate cream and evaluate the usage rationality of antimicrobial preservatives. MethodsThe content of ethyl hydroxybenzoate was calculated by external standard with HPLC.The effectiveness of antimicrobial preservatives was measured according to the preservative effectiveness test in ChP(2015edition) by inoculating 5 kinds of test microorganisms includingPseudomonasaeruginosa,Escherichiacoli,Staphylococcusaureus,CandidaalbicansandAspergillusniger. ResultsThe linear ranges of ethyl hydroxybenzoate was 6.63-132.6 μg/mL(r=0.999 7).The average recoveries was 99.2%.The samples from different batche had different antimicrobial effectiveness due to the content of ethyl hydroxybenzoate. ConclusionThe described method can be used in the determination of the preservatives of ethyl hydroxybenzoate in compound dexamethasone acetate cream. At present the use of antibacterial agent is arbitrary, it is necessary to strengthen research and supervision.

compound dexamethasone acetate cream;ethyl hydroxybenzoate;content determination;antimicrobial effectiveness

林琳，通信作者，女，硕士，住院医师，研究方向：心血管病用药，E-mail: 2198176768@qq.com。

R927.1

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.59