环丙沙星联合不同中药对金黄色葡萄球菌突变选择窗的影响

高咏涵，谢鲲鹏，谢明杰

(辽宁师范大学 生命科学学院/辽宁省生物技术与分子药物研发重点实验室，辽宁 大连 116081)

环丙沙星联合不同中药对金黄色葡萄球菌突变选择窗的影响

高咏涵，谢鲲鹏，谢明杰Δ

(辽宁师范大学 生命科学学院/辽宁省生物技术与分子药物研发重点实验室，辽宁 大连 116081)

目的 研究环丙沙星分别联合中药五倍子、黄柏和地榆对金黄色葡萄球菌突变选择窗(mutant selection window，MSW)的影响。方法 采用微量肉汤二倍稀释法测定环丙沙星、五倍子、黄柏和地榆4种药物单独使用及环丙沙星分别与3种中药联合使用对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)和防耐药变异浓度(mutant prevention concentration，MPC)，并计算联合用药后的MSW。结果 环丙沙星、五倍子、黄柏、地榆单用对金黄色葡萄球菌的MIC分别为0.2 μg/mL、12.5 μg/mL、0.4 mg/mL、0.2 mg/mL。MPC分别为1.6 μg/mL、200 μg/mL、2.56 mg/mL、0.352 mg/mL。环丙沙星分别与8 MIC五倍子、1/2 MIC黄柏和1 MIC的地榆联用后，可使环丙沙星对金黄色葡萄球菌的MSW均缩小了4倍；其中环丙沙星与4 MIC的黄柏联用能关闭金黄色葡萄球菌的MSW。结论 环丙沙星与五倍子、黄柏和地榆联用，可以明显降低各自单独用药对金黄色葡萄球菌的MPC，其中联合黄柏降低其MPC幅度最大，MSW缩小效果最好。对临床合理用药，防止细菌耐药性突变株的产生具有一定的指导意义。

金黄色葡萄球菌；环丙沙星；五倍子；黄柏；地榆；突变选择窗

金黄色葡萄球菌是威胁人类的重要病原菌，也是临床上常见的致病菌之一。环丙沙星是喹诺酮类药物中的一种高效广谱抗菌药[1]，长期被用于治疗金黄色葡萄球菌。随着环丙沙星在临床中用量的增加，金黄色葡萄球菌对环丙沙星的耐药率逐年上升[2-3]。Zhao等[4-5]提出的MSW理论认为，体内的药物浓度在病原菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)和防耐药变异浓度(mutation preventive concentration，MPC)之间时，耐药突变株会被选择性扩增，导致病原菌耐药。只有当药物浓度超过MPC值时才会抑制耐药菌产生。但在实际应用中，单药给药很难达到MPC，因此常采用联合用药的方法通过关闭或缩小MSW来防止耐药菌的产生。中药具有毒性低、来源广、价格低廉等优点。金建玲等[6]认为中西药联合使用在应对细菌抗药性方面具有多重优势。本文旨在通过体外测定环丙沙星与五倍子、黄柏和地榆联合用药后对金黄色葡萄球菌MIC和MPC的影响，研究联合用药是否能关闭或缩小金黄色葡萄球菌的突变选择窗(mutant selection window，MSW)，从而为临床合理用药，防止细菌耐药性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 供试菌株和培养基：金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC26112)，购于中国医学菌种保藏中心。MH肉汤和MH琼脂，购于中国药品生物制品鉴定所。

抗菌药物和试剂：环丙沙星(ciprofloxacin，CIP)：购于上海生工生物有限公司。五倍子、黄柏和地榆由辽宁师范大学中药现代化实验室提供。其他试剂购于赛拓(大连)生物科技有限公司。

仪器：THZ-82B气浴恒温振荡器(江苏省金坛市医疗仪器厂)。HPX-9082MBE电热恒温培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。TDL-5低速台式大容量离心机(江苏省金坛市医疗仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 五倍子、黄柏和地榆的制备：分别称取一定量的五倍子、黄柏和地榆，用浓度95%的乙醇在索氏提取器中热回流提取8 h，将提取液蒸干制成干粉。然后用无水乙醇配成10 mg/mL的药液，0.22 um滤器过滤备用。

1.2.2 环丙沙星、五倍子、黄柏和地榆对金黄色葡萄球菌MIC的测定：采用微量肉汤二倍稀释法[7-8]。在无菌96孔板中，分别加入100 μL培养至对数期的菌悬液(106cfu/mL)，再分别加入100 μL不同浓度的环丙沙星和五倍子等中药，使环丙沙星的终浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5 μg/mL；五倍子的终浓度为6.25、12.5、25、50 μg/mL；黄柏的终浓度为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μg/mL；地榆的终浓度为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μg/mL。每个浓度设3个复孔，以不加药的培养基作为对照，37 ℃下1000 r/min摇床中培养24 h。然后每孔分别加入20 μL浓度为0.2%的2,3,5-氯代三苯基四氮唑(TTC)，1000 r/min摇床下继续避光培养4 h。用肉眼观察，以没有红色还原物甲臢(TTC 是一种常用的活菌染料，其氧化态是无色的，该染料进入细胞后，TTC 和活细胞内的琥珀酸脱氢酶反应，生成红色的还原产物甲臜。因此活细胞为红色，死细胞为无色)产生的最低浓度作为暂定MIC。再以暂定MIC为基准，按照20%的抗菌药物浓度进行线性递减，重复MIC的测定步骤。以没有红色还原物甲臢产生的最低浓度作为最终的MIC。

1.2.3 环丙沙星、五倍子、黄柏和地榆对金黄色葡萄球菌MPC的测定[9-11]

① 含单药琼脂平板的制备：以单药的MIC为基准，用倍比稀释法分别制备含有环丙沙星、五倍子、黄柏和地榆的不同药物浓度MH琼脂平板(药物浓度梯度分别是1 MIC～16 MIC)，每个浓度制备4个平板。

② 含两药琼脂平板的制备：分别以环丙沙星、五倍子、黄柏和地榆4种药物的MIC和MPC为基准，采用倍比稀释法分别制备含环丙沙星和五倍子，环丙沙星和黄柏，环丙沙星和地榆的组合MH琼脂平板。药物浓度均从1/4 MIC到MPC，每个药物浓度的组合制备4个平板。

③ MPC结果的判定：将培养至对数期的金黄色葡萄球菌，调整到浓度为3×1010cFu/mL，然后，取100 μL细菌浓缩液置于所配制的含不同浓度药物的MH平皿上，涂布均匀，35 ℃培养72 h。以平皿中无细菌生长的最低药物浓度为暂定MPC(MPCpr)，再以MPCpr为基准，按照20%的抗菌药物浓度进行线性递减，重复MPC的测定步骤，重复3次，每个浓度3个平板，通过肉眼观察，以无菌生长的最低药物浓度作为最终的MPC。

2 结果

2.1 单独用药对金黄色葡萄球菌MIC和MPC的影响 实验结果显示，五倍子、黄柏和地榆均能抑制金黄色葡萄球菌的生长，且抑制作用呈浓度剂量依赖。单独用药对金黄色葡萄球菌的MIC和MPC结果见表1。

表1 单独用药对金黄色葡萄球菌MIC和MPC的影响(n=3)Tab.1 Effect of each drug on MIC and MPC of staphylococcas aureus(n=3)

2.2 环丙沙星联合用药对金黄色葡萄球菌MSW的影响 环丙沙星与五倍子、黄柏和地榆分别联合用药对金黄色葡萄球菌MSW的影响结果见表2、表3、表4。当环丙沙星分别与8 MIC五倍子、1MIC地榆和1/2 MIC黄柏联用后，环丙沙星对金黄色葡萄球菌的MSW均缩小了4倍；环丙沙星与4 MIC黄柏联用能完全关闭金黄色葡萄球菌的MSW。

表2 环丙沙星联合五倍子对金黄色葡萄球菌MSW的影响(n=3)Tab.2 Effect of ciprofloxacin combined with gallnut on the MSW of staphylococcus aureus(n=3)

“+”有耐药突变株生长，indicates that bacterial growing positively；“-”无耐药突变株生长，indicates that no bacterial growth

表3 环丙沙星联合黄柏对金黄色葡萄球菌MSW的影响(n=3)

“+”有耐药突变株生长，indicates that bacterial growing positively；“-”无耐药突变株生长， indicates that no bacterial growth

表4 环丙沙星联合地榆对金黄色葡萄球菌MSW的影响(n=3)

“+”有耐药突变株生长，indicates that bacterial growing positively；“-”无耐药突变株生长，indicates that no bacterial growth

3 讨论

目前临床应用抗菌药物一般遵循MIC理论，认为只要药物浓度高于MIC，就能够有效杀灭敏感菌[12]。但在实际应用中，这种用药原则是引起细菌产生耐药的原因之一。最新的MSW理论认为，当药物浓度位于MSW范围内时，耐药突变体会被选择性扩增，产生大量耐药菌。只有当药物浓度达到或超过MSW时，才会抑制耐药菌的产生。但增大给药剂量，使药物浓度达到MSW上限值时，会使机体产生严重不良反应，这种治疗方案在临床上也是不可行的。因此选用2种不同作用机制的抗菌药物联用，通过缩小或关闭MSW的方法是解决细菌耐药性的方法之一[13]。中药具有天然、污染小、副作用少、过敏反应少和不易产生抗药性等特点，能够克服抗生素滥用带来的弊端，因此中药逐渐成为研究的热点，中西药联合使用也成为减缓和控制细菌对抗生素耐药性逐年增长的一条可行性途径。本文研究了环丙沙星联合中药五倍子、黄柏、地榆对金黄色葡萄球菌突变选择窗(MSW)的影响。结果显示，环丙沙星联用一定浓度的五倍子、黄柏和地榆后，可降低环丙沙星对金黄色葡萄球菌的MPC，其中环丙沙星与4MIC的黄柏联用后能完全关闭金黄色葡萄球菌的MSW。因此将现有的抗菌药物与中药联合，通过缩小或关闭金黄色葡萄球菌的MSW的方法，可以有效地防止细菌耐药突变株的产生[16-17]。由于体内的药物浓度是处于一种动态的变化之中[18]，因此体外的研究结果，并不能简单的应用于临床，还应通过进一步的研究进行验证。

[1] 徐红云，刘春林，李宜铮，等.伤口感染病原菌分布 及耐药谱分析[J].中国微生态学杂志，2013，25(11)：1313-1316.

[2] 胡仁静，严子禾，胡锡池，等.金黄色葡萄球菌的耐药分析[J].职业与健康，2009，25(24)：2859-2860.

[3] 陈孝进，彭兰. 5年临床常见病原菌对环丙沙星耐药趋势[J].中华医院感染学杂志，2006，16(2)：216-217.

[4] Dong YZ,Zhao XL,Domagala J,et al.Effect of fluoroquilonone concentration on selection of resistant mutants of Mycobactenum bovis BCG and Staphylococcus aureus[J].Antimicro Agents Chemother,1999,43:1756-1758.

[5] Zhao XL, Drlica K.Restricting the selection of antibiotic·resistant mutants：a general strategy derived from fluoroquinolonestudies[J]. Clin Infect Dis,2001,33(l3)：147-156.

[6] 金建玲，徐轲，高培基，等.中西药联合使用在应对细菌抗药性方面的优势[J].中医药学报，2011，39(4)：1002-2392.

[7] 耿昕颖，葛铮，孔令聪，等. 52株不同淡水鱼类维氏气单胞菌耐药表型的分析[J].中国兽药杂志，2015，49(6)：1-5.

[8] 赵凌旭，王蕾.中药黄檗对金黄色葡萄球菌体外抑菌效果的初步研究[J].检验医学，2015，(9)：1673-8640.

[9] 李朝霞，刘又宁，王睿，等.左氧氟沙星联合万古霉素缩小金黄色葡萄球菌耐药突变选择窗的初步研究[J].中国临床药理学与治疗学，2007，12(8)：911-914.

[10] 张雨菡，王丽平，陆承平，等. 氟喹诺酮类抗茵药对临床分离猪链球菌的防耐药变异浓度测定及一步耐药突变株的筛选[J].畜牧兽医学报，2011，42(1)：71 -76.

[11] 姚国新，张丽华，汤远亮，等. 金黄色葡萄球菌防耐药突变浓度测定方法的影响因素分析[J].中国药师，2010，13(8)：1147-1148.

[12] 崔俊昌，刘又宁，王睿，等.4种氟喹诺酮类药物对金黄色葡萄球菌的防耐药变异浓度[J].中华医学杂志，2004，84(22)：1863-1866.

[13] Drlica K.A strategy for fighting antibiotic resistance[J].ASM News,2001,67:27-33.

[14] 陈晴，谢鲲鹏，云宝仪，等.黄柏等中草药对MRSA的抑菌作用及其对质粒的消除作用[J].微生物学杂志，2013，33(3)：1005-7021.

[15] 李仲兴，王秀华，张明明，等.五倍子乙醇提取物对金葡菌的体外抗菌研究[J].中药新药与临床药理，2005，16(2)：103-105.

[16] 刘淼，刘海凤，郑风劲.耐药突变选择窗与抗菌药物防耐药突变浓度的研究进展[J].四川解剖学杂志，2012，20(2)：1005-1457.

[17] 陈瑜，张智洁，孙继梅，等.四种氟喹诺酮药物对嗜麦芽寡养单胞菌防耐药变异浓度的测定[J].中国抗生素杂志，2016，3(14)：216-219.

[18] 盛美艳，张芸，刘明涛，等.环丙沙星在兔血液与组织液中的药动学[J].中国医药工业杂志，2010，41(7)：1001-8255.

(编校：吴茜)

Effect of ciprofloxacin combined with different Chinese traditional medicine on mutant selection window ofStaphylococcusaureus

GAO Yong-han, XIE Kun-peng, XIE Ming-jieΔ

(College of Life Science, Liaoning Normal University, Key Laboratory of Biotechnology and Drug Discovery of Liaoning Province, Dalian 11608, China)

ObjectiveTo study the influence of ciprofloxacin combined with Chinese traditional medicine gallnut, golden cypress and Sanguisorba officinalis on the mutant selection window(MSW) ofstaphylococcusaureus. MethodsThe minimal inhibitory concentration(MIC) and the mutant prevention concentration(MPC) of ciprofloxacin, gallnut, golden cypress, Sanguisorba officinalis each single and combined were measured by the method of broth dilution technique and MSW were calculates respectively.ResultsMIC of ciprofloxacin, gallnut,golden cypress and Sanguisorba officinalis for staphylococcus aureus separately were 0.2 μg/mL, 12.5 μg/mL, 0.4 mg/mL, 0.2 mg/mL and MPC separately were 1.6 μg/mL, 200 μg/mL, 2.56 mg/mL, 0.352 mg/mL. The combination of ciprofloxacin, 8 MIC gallnut,1/2 MIC golden cypress and 1 MIC Sanguisorba officinalis makes MSW of ciprofloxacin for staphylococcus aureus reduced by 4 times; the ciprofloxacin and 4 MIC of golden cypress in combination can close the MSW ofstaphylococcusaureus. ConclusionCompared with each one alone, the combination of ciprofloxacin separately with gallnut, golden cypress and Sanguisorba officinalis can obviously decrease the MPC of staphylococcus aureus, the combination of ciprofloxacin and golden cypress were more evidently in dropping the MPC ofstaphylococcusaureusand the effect of narrower MSW is the best, which give a certain guiding for rational drug use and prevention the production of mutant strains of bacterial resistance.

staphylococcusaureus;ciprofloxacin;gallnut;golden cypress; Sanguisorba officinalis; mutant selection window

高咏涵，女，学士在读，研究方向：生物科学，E-mail：106242825@qq.com；谢明杰，通信作者，女，博士，教授，研究方向：微生物生化，E-mail：xmj1222@sina.com。

R285.5

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.61