布鲁氏菌病诊断方法的比较分析及细菌的分离鉴定

叶 锋，马晓菁，李 静，易新萍，谷文喜，钟 旗（.新疆维吾尔自治区畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐，830000；.新疆兵团畜牧兽医工作总站，新疆乌鲁木齐，830000）



布鲁氏菌病诊断方法的比较分析及细菌的分离鉴定

叶 锋1，马晓菁1，李 静2，易新萍1，谷文喜1，钟 旗1
（1.新疆维吾尔自治区畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐，830000；2.新疆兵团畜牧兽医工作总站，新疆乌鲁木齐，830000）

摘 要：采集疑似布鲁氏菌病感染的牛奶和血清各82份，应用哈萨克斯坦共和国的布鲁氏菌病诊断复合抗原和国产抗原，分别对血清和奶样进行虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）和乳环凝集试验（MRT），用西班牙IELISA奶样检测试剂盒对奶样进行检测，并对所有阳性奶样进行细菌分离与PCR鉴定。结果显示，国产抗原和复合抗原的RBT结果与奶样IELISA总体符合率分别为65.85%和92.68%，SAT结果与奶样IELISA总体符合率分别为79.52%和90.24%，MRT结果与奶样IELISA总体符合率分别为79.27%和80.49%。PCR和AMOS-PCR检测结果显示分离菌株为羊种布鲁氏菌。结果表明，两种MRT抗原在血清和奶样检测中都存在漏检现象；从牛乳中分离到布鲁氏菌羊种3型，说明出现了跨种传播，应引起重视。

关键词：布鲁氏菌病；诊断方法；比较；分离鉴定

布鲁氏菌病（简称布病）是一种人兽共患传染性疾病，其分布广泛，严重威胁公共卫生事业和畜牧业发展，是国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020）中优先防治和重点防范的二类动物疫病。近年来，新疆地区家畜布病与人间布病暴发频繁，这给畜牧业带来巨大损失，给人民健康带来了较大威胁，而控制及消除布病的前提是能够对布病进行准确诊断［1］。

大多数人或动物感染布病后没有明显的临床表现，很难通过流行病学和临床症状进行确诊，而布鲁氏菌的分离鉴定不但需要的时间长，而且受采样时机等因素的影响很大，病菌检出率低，不利于布病的控制［2］。目前对于布病的诊断多采用血清学及病原学检测方法。本病的血清学诊断方法种类较多，主要检测血清或乳中的抗体。本研究应用哈萨克斯坦共和国布病诊断复合抗原、国产布病抗原、西班牙IELISA奶样试剂盒对血清和对应乳样进行RBT、SAT、IELISA及乳环凝集实验（MRT）比对分析，分离细菌并鉴定，为布病的诊断提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品。采集疑似布病牛血清82份、对应奶样82份。

1.1.2 试剂。RBT抗原和SAT抗原分别使用国内A厂家和哈萨克斯坦国家兽医研究所的动物布病复合抗原（以下简称复合抗原）；MRT抗原使用复合抗原；IELISA布病奶样检测试剂盒购自西班牙IDEXX公司；布鲁氏菌培养基（Brucella Broth）购自美国BD公司；改良Brucella选择添加剂（OXOID Ltd）、PCR mix购自北京庄盟生物技术有限公司；PCR引物合成于上海基康生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RBT和SAT。分别取国产抗原30 μL、复合抗原30 μL与血清30 μL混匀后，5 min内观察结果；血清稀释度从1∶25开始倍比稀释至

1∶200，分别加入10倍稀释的复合抗原和国产SAT抗原；复合抗原组37℃放置温箱2 h后观察结果，国产抗原组37℃温箱放置过夜观察结果；RBT和SAT实验分别设立阴阳性对照。

1.2.2 MRT。取冻融摇匀后奶样2 mL分别加入100 μL复合抗原和国产抗原，混匀后37℃温箱放置1 h后观察结果。

1.2.3 奶样IELISA检测。将奶样摇匀后每个检测孔加入100 μL，其余按试剂盒操作步骤执行。

1.2.4 奶样分菌［3］。将冻融的奶样摇匀后，吸取300 μL接种于含Brucella添加剂的布鲁氏菌培养基上，在5%CO2环境下37℃培养，4 d后观察菌落形态。

1.2.5 布鲁氏菌属的PCR鉴定［4］。挑取培养的疑似布鲁氏菌菌落置于含200 μL的TS液体培养基中，37℃孵育24 h，后对菌液进行100℃ 10 min灭活，离心后取上清液作为PCR模板。采用VirB8-PCR方法扩增布鲁氏菌的VirB8基因，进行菌属鉴定。

1.2.6 布鲁氏菌的种型鉴定［5］。参照文献AMOSPCR方法，组合插入序列IS711、牛种（1、2、4、3a 型）、牛种（5、6、9、3b 型）和羊种（1、2、3型）4个引物，优化PCR反应条件：94℃ 5 min、94℃60 s、60℃ 90 s、72℃ 60 s，40个循环；72℃ 10 min。对布鲁氏菌分离株进行种型鉴定。

2 结果

2.1 RBT和SAT

用哈萨克斯坦复合抗原对82份血清样品进行RBT的检测中有33份出现凝集，结果判定为阳性；国产抗原中有10份出现凝集，结果判为阳性。再分别以复合抗原和国产抗原为SAT抗原，对RBT检测结果为阳性样品进行检测，其中复合抗原检测出阳性样品30份，国产抗原检测出阳性样品20份，结果见表1。

2.2 MRT

将与被检血清样品对应的乳样2 mL分别与复合抗原和国产抗原各100 μL混匀，40 min后观察乳样表层是否有环状凝集。其中复合抗原检测乳样中有22份表层出现蓝色环状凝集，结果判定为阳性；国产抗原共检测出21份乳样出现红色环状凝集，结果判定为阳性。结果见表1 。

2.3 奶样IELISA实验

使用西班牙布病奶样IELISA检测试剂盒对82份奶样进行了检测，实验结果显示有40份奶样检测结果大于临界值，判定为阳性。

2.4 奶样分菌

将奶样300 μL接种于含Brucella添加剂的布鲁氏菌琼脂培养基，5%CO2环境下37 ℃培养4 d后，有9份样品在培养基上生长出圆形、无色、湿润、凸起的疑似菌落。

表1 血清和奶样RBT、SAT、MRT和IELISA检测结果

2.5 PCR鉴定

应用VirB8-PCR方法对疑似布病菌落进行PCR鉴定，以A19疫苗株为阳性对照，设阴性空白对照。VirB8-PCR鉴定结果显示，9个疑似菌落中有6个扩增出约730 bp的特异性片段，与阳性对照一致，阴性对照未见目的片段，结果见图1。

图1 分离菌株的virB8-PCR鉴定

2.6 布鲁氏菌种型鉴定

采用AMOS-PCR方法对VirB8-PCR结果阳性的分离株进行生物亚型鉴定，结果显示，在牛种A19疫苗株扩增出约500 bp的特异性片段，在羊种M5疫苗株扩增出750 bp的目的片段，在6株布鲁氏菌分离株全部扩增出约750 bp的目的片段，结果见图2。

图2 分离菌株的AMOS-PCR鉴定

3 讨论

本研究引进的哈萨克斯坦复合抗原可以同时对全血、血清、奶样进行检测，不仅可用于野外临时采样检测，也可在实验室中使用同一种抗原进行多种实验。在与国产抗原的血清学比对实验中，该抗原的敏感性和检出率高，易于观察结果，对于野外临检和基层普检都有重要的实际使用价值。

使用复合抗原对血清进行RBT和SAT实验，在特异性上较国产RBT和SAT抗原高。两种抗原在阳性符合率上都较高，在阴性符合率上则明显降低，说明在检测过程中有阳性样品出现了漏检。两种MRT抗原在奶样检测符合率上较为一致（分别为79.27%和80.49%），但也存在漏检现象。而布鲁氏菌只有在动物体内大量增殖时，奶样中分菌率才会较高，这也导致本研究中分菌率与血清阳性率存在较大的差异。

本研究从22份牛乳中分离到了6株布鲁氏菌羊种3型，说明出现了跨种传播，并且该种病菌具有在本地区流行的趋势。相对于其他亚型布鲁氏菌，羊种布鲁氏菌对人体的感染性和危害性更大，会严重威胁本地区的公共安全，应对其高度重视。本研究结果为新疆布鲁氏菌病的检测及流行病学调查提供了重要参考。

参考文献：

［1］任德坤，常青，师茂林，等.新疆布鲁氏菌病疫情现状与防治对策［J］.地方病通报，2008，23（5）：36-37.

［2］武文革，陈康，任德坤，等.布鲁氏菌病防治难点与对策［J］.地方病通报，2007，22（5）：67.

［3］易新萍，马晓菁，闫晶华，等.牛乳样品中布鲁氏菌的分离和鉴定［J］.中国预防兽医学报，2013，35（1）：28-30.

［4］钟旗，范伟兴，吴冬玲，等.布鲁氏菌VirB8-PCR方法的建立［J］.中国人兽共患病学报，2008，24（1）：50-54.

［5］钟旗，范伟兴，何倩倪，等.用AMOS-PCR对布鲁氏菌种型鉴定的研究［J］.中国人兽共患病学报，2007，23（7）：683-686.

［6］王远志，陈创夫，崔步云，等.羊种布鲁氏菌生物3型的分离和鉴定［J］.中国预防兽医学报，2007，29（10）：753-756.

［7］尚德秋.布鲁氏菌病流行病学及分子生物学研究进展［J］.中国地方病防治，1996，11（6）：339-348.

［8］Ocampo S A A，Balbin J.Development of a new PCR assay to identify Brucella abortus biovars 5 ，6 and 9 and the new subgroup 3b of biovar 3 ［J］.Vet Microbiol，2005，110（1-2）：41-51.

（责任编辑：朱迪国）

资助项目：新疆生产建设兵团科技局科技攻关项目（2013BA004）；新疆维吾尔自治区国际科技合作计划项目（20136005）；新疆公益性科研院所基金（KY2014008）

Comparison of Diagnostic Methods for Brucellosis and Bacterium Isolation and Identifi cation

Ye Feng1，Ma Xiaojing1，Li Jing2，Yi Xinping1，Gu Wenxi1，Zhong Qi1
（1.Veterinary Research Institute，Xinjiang Academy of Animal Science，Urumqi，Xinjiang 830000；2.Xinjiang Corps Animal Husbandry and Veterinary Work Station，Urumqi，Xinjiang 830000）

Abstract：82 milk samples and 82 serum samples from suspicious brucellosis infected animals were collected.Serum and milk samples were detected by RBT，SAT and MRT by using Kazakhstan complex antigen and domestic antigen respectively.And milk samples were detected by Spain IELISA reagent kit and milk ring test.The positive milk samples in the previous tests were isolated and identifi ed by PCR.The results showed that coincidence rate between using Kazakhstan complex antigen and domestic antigen with IELISA for RBT was 65.85% and 92.68%，coincidence ratefor SAT was 79.52% and 90.24% and coincidence rate for MRT was 79.27% and 80.49%，respectively.Positive milk samples were cultured and used to isolate.Bacterium PCR and AMOS-PCR results showed that the isolates were Brucella melitensis.The results showed that false negatives were existed in MRT detection for milk and sera by using Kazakhstan complex antigen and domestic antigen.Brucella melitensis was isolated from milk，which demonstrated that the disease spread across the species.It should be paid much attention to.

Key words：brucellosis；diagnostic method；comparison；identifi cation

中图分类号：S851.3

文献标识码：B

文章编号：1005-944X（2016）02-0066-04

通讯作者：钟 旗